在缺氧條件下持續(xù)刺激引起的線粒體應(yīng)激快速驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞衰竭

2021年6月，最新一篇發(fā)表在Nat Immunol.（IF=25.600）的文章（Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion.）當(dāng)腫瘤內(nèi)衰竭T細(xì)胞經(jīng)歷嚴(yán)重缺氧時(shí)，他們假設(shè)代謝應(yīng)激會(huì)改變其對(duì)其他信號(hào)的反應(yīng)，特別是持續(xù)的抗原刺激。在體外，盡管單獨(dú)經(jīng)歷連續(xù)刺激或缺氧的CD8 + T細(xì)胞分化為功能性效應(yīng)物，但這種組合迅速驅(qū)動(dòng)了與衰竭一致的T細(xì)胞功能障礙。連續(xù)刺激促進(jìn)了Blimp-1介導(dǎo)的PGC-1α依賴性線粒體重編程阻遏作用，使細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)較差。線粒體功能的喪失產(chǎn)生了無(wú)法耐受的活性氧（ROS）水平，足以促進(jìn)衰竭狀態(tài)，部分原因是通過磷酸酶抑制和隨后活化T細(xì)胞核因子的活性。減少T細(xì)胞固有的ROS和降低腫瘤缺氧限制了T細(xì)胞衰竭，與免疫療法協(xié)同作用。因此，免疫信號(hào)和代謝信號(hào)之間存在內(nèi)在聯(lián)系：通過減輕代謝壓力，可以改變T細(xì)胞分化，從而促進(jìn)更多的功能性細(xì)胞命運(yùn)。

背景：T細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，它整合了來(lái)自環(huán)境的大量信號(hào)，參與轉(zhuǎn)錄機(jī)制，并進(jìn)行表觀遺傳改變來(lái)支持新的功能程序。對(duì)于CD8+ T細(xì)胞，這導(dǎo)致獲得不同的命運(yùn):短命的細(xì)胞毒性效應(yīng)程序和長(zhǎng)壽命的自我更新記憶程序。然而，在抗原持續(xù)存在的病理中，特別是慢性感染和癌癥中，會(huì)誘導(dǎo)一種替代效應(yīng)或記憶分化的命運(yùn):T細(xì)胞衰竭。在持續(xù)的炎癥提示下，T細(xì)胞逐漸失去多功能和更新能力，無(wú)法控制感染或惡性擴(kuò)散。T細(xì)胞逐步上調(diào)共抑制分子，最終達(dá)到最終分化狀態(tài)，表達(dá)高水平的PD-1和多種共抑制和共刺激標(biāo)志物(lag3, Tim-3, TIGIT，和4 1BB)。衰竭的細(xì)胞由幾種轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)定義，包括Eomesodermin、BATF、無(wú)伴侶NFAT1、TOX和轉(zhuǎn)錄抑制因子Blimp-1，利用改變的表觀遺傳環(huán)境定義功能失調(diào)譜系。衰竭有一個(gè)不斷演變的定義，而且只能在體內(nèi)可靠地產(chǎn)生，這嚴(yán)重限制了識(shí)別這種命運(yùn)的驅(qū)動(dòng)因素的能力。

分化通常與T細(xì)胞接收的免疫信號(hào)有關(guān):共刺激或細(xì)胞因子信號(hào)支持一種或另一種命運(yùn)。然而，環(huán)境的代謝組成、檢測(cè)該環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)傳感器以及T細(xì)胞固有的代謝狀態(tài)也對(duì)決定分化的最終結(jié)果至關(guān)重要。代謝信號(hào)是理解的關(guān)鍵，因?yàn)門細(xì)胞的激活和分化發(fā)生在各種代謝不同的組織環(huán)境。在癌癥中，腫瘤細(xì)胞代謝的升高可以顯著改變T細(xì)胞所經(jīng)歷的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。我們之前的研究表明，T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤時(shí)存在嚴(yán)重的代謝缺陷:葡萄糖攝取能力受到抑制，功能性線粒體質(zhì)量喪失，伴隨衰竭的發(fā)展。我們和其他人也表明，糾正這種錯(cuò)誤的代謝狀態(tài)(通過各種方法)可以增強(qiáng)免疫功能，實(shí)現(xiàn)免疫治療效果。

例如，雖然之前認(rèn)為抗PD-1可以阻斷最末期枯竭的T細(xì)胞上的PD-1信號(hào)，但這種直接模型已經(jīng)受到質(zhì)疑，表明PD-1成功阻斷可能作用于分化較低的類祖細(xì)胞，高比例的腫瘤浸潤(rùn)最終耗盡的T細(xì)胞預(yù)測(cè)抗pd -1的耐藥。此外，雖然代謝相關(guān)因素，如腫瘤細(xì)胞消耗氧氣和產(chǎn)生缺氧的能力，可以預(yù)測(cè)對(duì)PD-1阻斷劑的抗性18，但這些環(huán)境壓力源已被證明對(duì)T細(xì)胞功能有不同的影響。缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF1α)及其負(fù)調(diào)控因子此前已被證實(shí)與T細(xì)胞激活有關(guān)23，而在缺氧條件下治療細(xì)胞的擴(kuò)張可增強(qiáng)腫瘤殺傷能力。然而，無(wú)論是在隔離狀態(tài)還是在體內(nèi)，缺氧都具有明顯的免疫抑制作用。因此，雖然代謝壓力和T細(xì)胞衰竭有聯(lián)系，但尚不清楚T細(xì)胞衰竭是否促進(jìn)了導(dǎo)致細(xì)胞代謝改變的程序，或者是否代謝不足和壓力直接導(dǎo)致了T細(xì)胞衰竭。

技術(shù)路線：

一、耗盡的腫瘤內(nèi)T細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷嚴(yán)重的缺氧

雖然缺氧在腫瘤中很常見，但尚不清楚腫瘤內(nèi)T細(xì)胞亞群是否比其他T細(xì)胞更容易缺氧。我們首先在8-10 mm(第14天)B16黑色素瘤中沿著衰竭譜對(duì)CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)進(jìn)行表型分析(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a)。最終衰竭的T細(xì)胞被定義為高水平和持續(xù)表達(dá)PD-1和共表達(dá)Tim-3(圖1a)，具有高的LAG3和Tox表達(dá)，低的TCF1表達(dá)，通過將gp100特異的Pmel-1 T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到攜帶b16的小鼠中，一旦它們達(dá)到最終衰竭，就會(huì)重新刺激它們，從而測(cè)定抗原特異性反應(yīng)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b)。與LN-resident Pmel-1 T細(xì)胞相比，gp100-restimulated T細(xì)胞的多功能性要少得多(圖1f)。在處死B16腫瘤小鼠之前，將其注入一種缺氧示蹤劑吡莫硝唑，使用抗吡莫硝唑和抗hif1 α抗體，發(fā)現(xiàn)與其他亞群相比，最終耗盡的T細(xì)胞缺氧程度最高(圖1g,h)。因此，缺氧是腫瘤代謝景觀的主要代謝組成部分，與其他亞群相比，最終衰竭的T細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷更高的缺氧。

二、在缺氧條件下持續(xù)刺激的T細(xì)胞出現(xiàn)衰竭

為了確定缺氧是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰竭，在體外建立暴露于缺氧應(yīng)激的模型。a，體外CD8+ T細(xì)胞d10的TNF和IFN-γ的產(chǎn)生，在缺氧或缺氧條件下，用抗cd3 /CD28珠急性或持續(xù)激活d2- 5，然后在常氧或缺氧條件下額外培養(yǎng)5天。b，，圖2中使用的刺激方案生成的第3天CD8+ T細(xì)胞CTV稀釋液的代表性直方圖和division分析。c, CD8+ T細(xì)胞的擴(kuò)增(左)和累積倍增(右)。d，第3天或第4天產(chǎn)生的CD8+ T細(xì)胞的染色稀釋(增殖)與細(xì)胞死亡(活/死)染色。e, PD-1在cd4 + T細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度。.f–h。第3天CD8+ T細(xì)胞的流式圖。

三、在缺氧條件下的持續(xù)激活誘導(dǎo)不同的細(xì)胞內(nèi)程序

已知的缺氧信號(hào)靶點(diǎn)BNIP3在缺氧下升高，mTORC1在持續(xù)刺激下被激活(圖3a)。從這四種條件中獲得的RNA序列被用來(lái)比較培養(yǎng)物和之前公布的數(shù)據(jù)之間的轉(zhuǎn)錄組。主成分分析顯示，所有四個(gè)群體的轉(zhuǎn)錄組都不同(圖3b)。缺氧條件下的持續(xù)刺激并沒有誘導(dǎo)持續(xù)刺激和缺氧誘導(dǎo)基因的組合，而是驅(qū)動(dòng)了一個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄譜(圖3c）?；虮倔w論表明，連續(xù)刺激條件之間共享的基因簇與負(fù)調(diào)控和代謝變化相關(guān)(簇3和簇5)(圖3b)。與缺氧條件下持續(xù)刺激相關(guān)的基因(聚類1和7)主要由抗病毒和抗增殖基因驅(qū)動(dòng)。

四、Blimp-1在持續(xù)刺激下抑制PGC1α

持久抗原對(duì)于改變向衰竭分化至關(guān)重要，但其代謝后果尚不清楚。由于連續(xù)的刺激不產(chǎn)生明顯的代謝抑制，持續(xù)的刺激可能激活一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，阻止代謝重編程。Blimp-1(由Prdm1編碼)就是這樣一種抑制因子，在B16黑色素瘤中最終耗盡的CD8+ T細(xì)胞中高度上調(diào)(圖4a)，并在缺氧條件下持續(xù)激活(圖4b)。體外缺氧條件下持續(xù)激活的T細(xì)胞也抑制PGC1α的表達(dá)(圖4c)。 進(jìn)一步確定Blimp-1是否可以抑制PGC1α，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)制表達(dá)Blimp-1可以抑制293T細(xì)胞中Ppargc1a啟動(dòng)子構(gòu)建的活性，而不影響其活力(圖4d)。Prdm1f/fCd4Cre小鼠的CD8+ T細(xì)胞通過在缺氧條件下持續(xù)激活而抵抗功能障礙(圖4e,f)，而在持續(xù)激活條件下無(wú)法抑制Ppargc1a的表達(dá)(圖4g)。在PD-1hiTim3+ TILs中，Blimp-1的缺失導(dǎo)致了通過IL-2和腫瘤壞死因子(TNF)產(chǎn)生的線粒體質(zhì)量和多功能性的恢復(fù)(圖4h, i)。

五、ROS通過作為磷酸酶抑制劑來(lái)驅(qū)動(dòng)衰竭

腫瘤浸潤(rùn)PGC1α oe Pmel-1 T細(xì)胞在腫瘤浸潤(rùn)時(shí)線粒體ROS減少(圖5a)，表明PGC1α部分作用于腫瘤浸潤(rùn)時(shí)ROS的減少。 內(nèi)源性B16 TIL檢查顯示，最終耗盡的T細(xì)胞含有大量的mtROS(圖5b)。體外缺氧條件下的持續(xù)激活也產(chǎn)生了高水平的mtROS(圖5c)，表明ROS可能是T細(xì)胞衰竭的驅(qū)動(dòng)因素(圖5d,e)。低、無(wú)毒劑量的藥物用于培養(yǎng)T細(xì)胞數(shù)天，激活T細(xì)胞(24小時(shí))，然后在抗霉素A存在的情況下擴(kuò)增，會(huì)導(dǎo)致衰竭樣功能障礙:共同抑制分子高表達(dá)，多功能性減少(干擾素-g (IFN-γ)和TNF的產(chǎn)生)(圖)。5 f, g)。添加魚藤酮，當(dāng)添加到抗霉素A處理時(shí)，整個(gè)電子傳遞鏈崩潰，挽救了功能障礙，表明所觀察到的衰竭不是由于線粒體功能的喪失，而是由于線粒體應(yīng)激和隨后的ROS(圖5d-g)。為了進(jìn)一步解決ROS驅(qū)動(dòng)功能障礙的作用，我們使用n -乙酰半胱氨酸(NAC)，一種中和ROS的細(xì)胞滲透性抗氧化劑(圖5h)。NAC能夠防止抗霉素A或缺氧下持續(xù)刺激引起的功能障礙(圖5i m)。

ROS及其細(xì)胞副產(chǎn)物是酪氨酸磷酸酶的有效抑制劑，、用抗霉素A培養(yǎng)T細(xì)胞可導(dǎo)致酪氨酸磷酸化的持續(xù)和升高(圖6a)，這被魚藤酮或NAC阻斷(圖6a,b)。免疫印跡分析顯示，在aa誘導(dǎo)的ROS下，酪氨酸磷酸化的絕對(duì)數(shù)量增加，但幾種不同的蛋白在NAC處理下有差異的磷酸化(圖6b)。TCR-reporter Nur77-GFP小鼠研究表明在TCR信號(hào)缺失的情況下，抗霉素A誘導(dǎo)GFP表達(dá);在低于連續(xù)刺激條件下誘導(dǎo)的信號(hào)時(shí)，抗霉素A處理產(chǎn)生的GFP與酪氨酸磷酸酶抑制劑orthovandate (50 μm)培養(yǎng)的T細(xì)胞表型相匹配(圖6c)。磷酸酪氨酸級(jí)聯(lián)促進(jìn)NFAT1的核積累，單獨(dú)的ROS誘導(dǎo)(通過抗霉素A)以魚藤酮抑制的方式促進(jìn)NFAT1核的增加(圖d).

六、減輕ROS或缺氧可緩解T細(xì)胞衰竭

Pmel-1 T細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)Gpx1, Gpx1是一種谷胱甘肽過氧化物酶和已知的能作用于許多ROS物種的PGC1α靶點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)移到攜帶b16的動(dòng)物體內(nèi)。與pgc1 α轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞一樣，gpx1過表達(dá)的T細(xì)胞對(duì)腫瘤中ROS的積累具有抗性(圖7a)。過表達(dá)gpx1的TIL T細(xì)胞保持功能，產(chǎn)生更多的ifn - γ(圖7b)。因此，通過細(xì)胞固有的方式減少ROS可以保護(hù)T細(xì)胞免受腫瘤誘導(dǎo)的衰竭。Ndufs4缺乏的腫瘤在體外沒有明顯的氧消耗，在體內(nèi)產(chǎn)生較少的缺氧(圖7c,d)。在這些內(nèi)源性的浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞中，較小比例的細(xì)胞發(fā)展到最終衰竭(圖7e)。然而，雖然這些細(xì)胞仍然表達(dá)多種共抑制分子，但浸潤(rùn)Ndufs4缺陷腫瘤的PD-1hiTim3+ T細(xì)胞顯示多功能性增加(圖7f)。用低劑量(10 mg/kg)阿西替尼治療b16小鼠降低了腫瘤總量和用吡莫唑測(cè)量的T細(xì)胞缺氧(圖7g,h)。瘤內(nèi)T細(xì)胞表型上耗竭較少(圖7i)，多功能性較多(圖7j)，提示通過靶向VEGFR和降低缺氧，T細(xì)胞可能對(duì)免疫治療更敏感。在體內(nèi)用低劑量阿西替尼治療荷瘤小鼠可使荷瘤小鼠對(duì)CTLA-4和PD-1阻斷劑致敏，降低腫瘤負(fù)擔(dān)并提高生存率(圖7k)。通過靶向腫瘤微環(huán)境的缺氧特性，T細(xì)胞不會(huì)分化到終末衰竭，并保持對(duì)檢查點(diǎn)封鎖的反應(yīng)。