鼻咽癌來源的細(xì)胞外囊泡miR-144刺激血管生成

 越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞外囊泡（EVs）通過促進(jìn)實(shí)體腫瘤中腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞之間的通訊來刺激血管生成。先前的研究表明miR-144是鼻咽癌（NPC）細(xì)胞來源的EVs中的內(nèi)含物之一，但EVs miR-144對(duì)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的影響尚不清楚。2021年3月發(fā)表于“Molecular Therapy”（IF=11.454）的文章“miR-144 delivered by nasopharyngeal carcinoma-derived EVs stimulates angiogenesis through the FBXW7/HIF-1a/VEGF-A axis”對(duì)此展開了研究。本研究旨在探討腫瘤源性細(xì)胞外囊泡(EVs)在鼻咽癌血管生成中的作用。我們初步采集鼻咽癌活檢標(biāo)本。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)與鼻咽癌細(xì)胞分離的EVs共培養(yǎng)后，通過Transwell室系統(tǒng)和matrigel基血管生成實(shí)驗(yàn)評(píng)估其遷移、侵襲和血管樣管形成。使用體內(nèi)Matrigel血管生成模型檢測(cè)EVs的促血管生成活性以及候選microRNA 。結(jié)果表明，與鼻咽癌正常組織相比，鼻咽癌組織中miR-144水平上調(diào)，且與CD31的表達(dá)呈正相關(guān)。此外，miR-144在鼻咽癌細(xì)胞EVs中高度富集，最終增強(qiáng)HUVECs和血管樣管在體內(nèi)和體外的遷移和侵襲。值得注意的是，miR-144通過抑制靶基因FBXW7和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α依賴的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)。綜上所述，本研究強(qiáng)調(diào)了miR-144作為鼻咽癌腫瘤發(fā)生中細(xì)胞外促血管生成介質(zhì)的作用。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）miR-144在鼻咽癌組織和細(xì)胞中上調(diào)

先前的文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)了miR-144在NPC發(fā)展過程中的促癌作用。我們首先確定miR-144在NPC中的表達(dá)模式。采用qRT-PCR方法分析95例鼻咽癌活檢標(biāo)本和95例慢性鼻咽炎鼻咽活檢標(biāo)本中miR-144的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-144在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平高于在非癌性鼻咽組織中的表達(dá)水平(圖1A)，并通過原位雜交(ISH)進(jìn)一步驗(yàn)證(圖1B)。如圖1C所示，相對(duì)于非癌性鼻咽組織，鼻咽癌組織中CD31的免疫組化染色增強(qiáng)。在鼻咽癌組織中，CD31的表達(dá)與miR-144的表達(dá)呈正相關(guān)(圖1D)。隨后，我們通過qRT-PCR比較了人鼻咽癌細(xì)胞系(C666-1和SUNE1)和鼻咽上皮細(xì)胞系NP69之間miR-144的表達(dá)水平。與預(yù)期的一樣，C666-1和SUNE1細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)于NP69更高水平的miR-144表達(dá)(圖1E)。以上結(jié)果提示，miR144在鼻咽癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，與CD31表達(dá)呈正相關(guān)，表明miR144與腫瘤血管生成具有潛在的相關(guān)性。

2）miR-144在鼻咽癌細(xì)胞釋放的EVs中高度富集

接下來，為了確定腫瘤分泌的miR-144是否具有通過EVs細(xì)胞外通信影響腫瘤-微環(huán)境串?dāng)_的能力，我們首先從C666-1、SUNE1和NP69細(xì)胞中分離EVs。透射電子顯微鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)，納米顆粒的直徑為30 ~ 100 nm，每個(gè)囊泡呈杯狀(圖2A)。免疫印跡顯示，與相應(yīng)的細(xì)胞裂解液相比，這些來自C666-1、SUNE1和NP69細(xì)胞的納米顆粒中存在常見的EVs特異性標(biāo)記物，包括CD9、CD63和TSG101，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白calnexin明顯缺失(圖2B)。納米顆粒示蹤分析(NTA)進(jìn)一步顯示EV的平均直徑為94.1 nm (C666-1細(xì)胞)、90.5 nm (SUNE1細(xì)胞)和68.5 nm (NP69細(xì)胞)(圖2C)。此外，我們檢測(cè)了C666-1、SUNE1和NP69細(xì)胞衍生EVs的表面電荷(圖2D)。添加RNase對(duì)這三種細(xì)胞系的EVs中miR-144的表達(dá)沒有影響，而Triton X-100處理的細(xì)胞中miR-144的表達(dá)明顯降低，說明細(xì)胞膜對(duì)miR-144的表達(dá)具有保護(hù)作用(圖2E)。結(jié)果表明，這三種細(xì)胞系的EVs具有穩(wěn)定的膜態(tài)，對(duì)RNA具有保護(hù)作用。通過qRT-PCR檢測(cè)EVs中miR-144的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-144在鼻咽癌細(xì)胞EVs中表達(dá)高水平(圖2F)。這些發(fā)現(xiàn)為miR-144在npc細(xì)胞來源的ev中上調(diào)提供了證據(jù)。

3）miR-144通過EVs從鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)入HUVECs，增強(qiáng)了HUVECs的遷移和侵襲

既往文獻(xiàn)證實(shí)血管生成需要內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力。因此，我們?cè)噲D研究NPC-EVs分泌的miR144對(duì)HUVECs遷移和侵襲的影響，以闡明腫瘤分泌的miR-144在血管生成中的作用。首先，在熒光顯微鏡下觀察HUVECs在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PKH67標(biāo)記EVs的攝取。結(jié)果證實(shí)了HUVECs細(xì)胞質(zhì)中存在PKH67信號(hào)，提示HUVECs已被HUVECs內(nèi)吞。隨著時(shí)間的推移，與NP69-EV組相比，C666-1-EV組和SUNE1-EV組的HUVECs逐步表現(xiàn)出更大程度的EV內(nèi)化(圖3A)。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-144在經(jīng)C666-1和SUNE1釋放的EVs處理的HUVECs中的表達(dá)較高(圖3B)。為了進(jìn)一步證明鼻咽癌細(xì)胞分泌的EVs miR-144對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，我們轉(zhuǎn)染了C666-1和SUNE1細(xì)胞系，然后提取EV。qRT-PCR結(jié)果表明，暴露于miR-144模擬物處理的鼻咽癌細(xì)胞的HUVECs中miR-144上調(diào)，而暴露于miR-144 inhibitor處理的鼻咽癌細(xì)胞的HUVECs中miR-144下調(diào)(圖3C)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-144過表達(dá)EVs足以增強(qiáng)HUVECs的遷移和侵襲，而miR-144抑制EVs則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)(圖3D和3E)。此外，我們還通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs的增殖和遷移能力(圖3F)。結(jié)果顯示，與NC模擬EV組相比，miR-144模擬EV組細(xì)胞的創(chuàng)面愈合率升高，說明C666-1-和SUNE1細(xì)胞來源的EV miR-144均促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移。與NC抑制EV組相比，miR-144抑制EV組的細(xì)胞創(chuàng)面愈合率降低，提示C666-1-和SUNE1 EV細(xì)胞EV miR-144抑制后，HUVECs的增殖和遷移受到抑制。

4）NPC-EVs通過轉(zhuǎn)染miR-144增強(qiáng)體外和體內(nèi)HUVECs的血管樣管形成

我們?cè)u(píng)估NPC-EVs來源的miR-144對(duì)HUVECs血管樣管結(jié)構(gòu)的影響，以闡明腫瘤分泌的miR-144在血管生成中的作用。基于基質(zhì)膠的體外血管生成實(shí)驗(yàn)(圖4A)表明，miR-144模擬物處理的鼻咽癌細(xì)胞EVs顯著促進(jìn)了體外HUVECs的血管樣管形成，這與miR-144抑制劑處理的鼻咽癌細(xì)胞EVs的結(jié)果形成了鮮明對(duì)比。接下來，為了進(jìn)一步證明NPC-EVs來源的miR-144的促血管生成活性，我們?cè)诼闶笾羞M(jìn)行了體內(nèi)Matrigel實(shí)驗(yàn)，以鑒定移植凝膠栓中新形成的血管(圖4B和4C)。我們發(fā)現(xiàn)，來自miR-144模擬處理的鼻咽癌細(xì)胞的EVs增強(qiáng)了凝膠塞中新形成的增強(qiáng)血管，而來自miR-144抑制劑處理的鼻咽癌細(xì)胞的EVs則降低了血管，這與體外基質(zhì)凝膠血管生成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致?；谏鲜鼋Y(jié)果，NPC-EVs來源的miR-144增強(qiáng)了體外和體內(nèi)HUVECs的血管樣管形成。

5）miR-144升高導(dǎo)致FBXW7下調(diào)，HIF-1α上調(diào)

近期研究表明，FBXW7在血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和炎癥、內(nèi)皮屏障完整性和血管生成中發(fā)揮重要作用。隨后，我們開始闡明miR-144在鼻咽癌中促血管生成功能的分子機(jī)制。我們預(yù)測(cè)了miR-144在3‘UTR FBXW7 mRNA的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。與miR-144 模擬物共轉(zhuǎn)染后，FBXW7的野生型(WT)報(bào)告基因啟動(dòng)子的熒光素酶活性低于突變型(MUT) 3’UTR (圖5B)。在mRNA水平和蛋白水平比較鼻咽癌組織和非癌性鼻咽組織中FBXW7的表達(dá)。如圖5C和5D所示，FBXW7在鼻咽癌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)低于非癌性鼻咽組織。Pearson相關(guān)分析顯示，鼻咽癌組織中miR-144的表達(dá)與FBXW7的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5E)。我們還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非癌性鼻咽組織，鼻咽癌組織中FBXW7的免疫組化染色程度下降(圖5F)。與NP69細(xì)胞相比，C666-1和SUNE1細(xì)胞FBXW7的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于NP69細(xì)胞(圖5G和5H)。既往研究表明，FBXW7/HIF-1α/ VEGF-A通路參與腫瘤血管生成。因此，我們假設(shè)miR-144的促血管生成功能是通過在癌變過程中調(diào)節(jié)FBXW7/HIF-1α/VEGF-A通路實(shí)現(xiàn)的。在本研究中，我們首先在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)暴露于鼻咽癌EVs的HUVECs中FBXW7和HIF-1α。而HUVECs上清中用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定VEGF-A濃度(圖5I和5J)。結(jié)果顯示，暴露于miR-144模擬物的EVs中FBXW7的表達(dá)減少，而HUVECs上清液中HIF-1α和VEGFA的表達(dá)增加。miR-144抑制劑的引入導(dǎo)致EVs中FBXW7表達(dá)增加，HIF -1α表達(dá)減少，HUVECs上清VEGF-A濃度降低。此外， FBXW7過表達(dá)或HIF-1α沉默導(dǎo)致HUVECs上清中HIF-1α表達(dá)和VEGF-A濃度降低(圖5K和5L)。因此，miR-144可以靶向FBXW7，促進(jìn)HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)。

6）miR-144通過FBXW7/HIF-1α/ VEGF-A通路發(fā)揮促血管生成功能

我們確定NPC-EV來源的miR-144是否通過介導(dǎo)FBXW7/HIF-1α/VEGF-A通路促進(jìn)HUVECs的血管樣管形成。免疫印跡分析結(jié)果表明，在miR-144抑制劑處理的鼻咽癌細(xì)胞來源的EVs中，si-FBXW7處理導(dǎo)致FBXW7表達(dá)下調(diào)，HIF-1α和VEGF-A表達(dá)升高。這表明miR-144對(duì)HIF-1α/VEGF-A通路的影響是以FBXW7依賴的方式發(fā)生的(圖6A)。同樣地，我們還發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)抑制miR-144相比，聯(lián)合抑制miR-144和FBXW7后，HUVEC的遷移(圖6B)和侵襲(圖6C)增強(qiáng)，以及血管樣管形成(圖6D)增加，這表明miR-144在體外依賴于FBXW7的促血管生成功能。體內(nèi)Matrigel栓試驗(yàn)(圖6E和6F)顯示，與單獨(dú)抑制miR-144相比，包含miR144模擬物處理過的鼻咽癌細(xì)胞EVs的凝膠栓在miR-144和 FBXW7抑制聯(lián)合作用下，新形成的血管增強(qiáng)了，說明NPC-EV miR-144在體內(nèi)依賴于FBXW7的促血管生成功能。

結(jié)論：總之，本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)為EV來源的miR-144在體外鼻咽癌的進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用提供了證據(jù)。具體來說，miR-144可以通過鼻咽癌細(xì)胞來源的EVs轉(zhuǎn)運(yùn)到HUVECs，最終強(qiáng)化其惡性表型，為鼻咽癌基于EVs的生物標(biāo)志物和治療方式的發(fā)展提供了一個(gè)新靶點(diǎn)。