新連接——GOT1抑制通過ferroptosis促進胰腺癌細胞死亡

癌癥代謝被重新連接，以支持細胞生存，以應(yīng)對內(nèi)在和環(huán)境的壓力。鑒定靶向這些適應(yīng)機制的策略是一個活躍的研究領(lǐng)域。作者此前發(fā)現(xiàn)GOT1驅(qū)動通路在胰腺癌中維持氧化還原平衡。在這里，作者試圖鑒定GOT1抑制后的大寫依賴以表征胰腺癌的特征并為氧化還原代謝提供新的見解。本文于2021年8月發(fā)表在《Nature Communications》IF：14.919期刊上。

技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果：

1、PDA細胞利用GOT1促進細胞增殖和腫瘤生長

作者此前的工作證明，胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）細胞重新連接蘋果酸-天冬氨酸穿梭線以生成NADPH（Fig. 1a）。為了確定GOT1在PDA中使用時間控制，作者使用dox敲除分別GOT1的編碼區(qū)和3’UTR（sh1和sh3），以及對照shNT。結(jié)果顯示sh1和sh3顯著敲除GOT1的表達并細胞集落形成（Fig. 1b, c）。在18個細胞系中，有12個細胞系的GOT1敲除顯著損害了菌落形成（Fig. 1d）。但是對GOT1敲除的響應(yīng)不依賴于蘋果樹-天冬氨酸穿梭酶的表達狀態(tài)。然后檢測GOT1對已建立的小鼠PDA腫瘤的抑制作用。結(jié)果顯示，dox誘導(dǎo)GOT1敲除后，GOT1敏感細胞株表現(xiàn)出明顯的生長抑制（Fig. 1e, f）。這些結(jié)果表明PDA利用GOT1促進細胞增殖和腫瘤生長。

圖1 對于細胞增殖和腫瘤生長來說GOT1是PDA必須的

2、限制外源性胱氨酸可增強GOT1抑制

由于與非轉(zhuǎn)化細胞相比，GOT1抑制在PDA中具有獨特的細胞抑制作用，因此作者試圖識別由GOT1敲低誘導(dǎo)的代謝缺陷，從而靶向殺死PDA。為了該目的，作者檢測了GOT1敲低PDA細胞對代謝靶向小分子反應(yīng)的敏感性。對細胞進行5天的dox處理以確保GOT1敲除，然后再進行3天的藥物處理（Fig. 2a）。與一些抑制劑聯(lián)合使用時，GOT1抑制是有保護作用的，表現(xiàn)為曲線值下的面積增加，這是一種藥物敏感性的測量（Fig. 2b）。5種最常用的脫敏劑中有3種是化療藥物，這與之前的觀察結(jié)果一致。相比之下，GOT1敲除增強了erastin的敏感性（Fig. 2b, c）。Erastin是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的抑制劑，它將胱氨酸轉(zhuǎn)運到細胞中以交換谷氨酸。胱氨酸，半胱氨酸的氧化二聚體，在進入細胞后被還原為半胱氨酸，在細胞內(nèi)它可以促進谷胱甘肽和蛋白質(zhì)的合成，以及許多其他生化命運。GOT1敲除增強了PDA細胞系的erastin敏感性（Fig. 2d）并且與dox是否干擾無關(guān)。這種GOT1增強效應(yīng)被erastin類似物咪唑酮erastin (IKE) 復(fù)制，而和IKE聯(lián)合處理可導(dǎo)致部分細胞毒性（Fig. 2e）。與單一處理組相比，erastin或IKE處理GOT1敲除細胞減少了細胞數(shù)量，但這可以通過補充外源性半胱氨酸、谷胱甘肽來源GSH-EE或NAC而反轉(zhuǎn)（Fig. 2f）。這與胱氨酸導(dǎo)入到系統(tǒng)xc維持谷胱甘肽水平至關(guān)重要的結(jié)果一致。在PDA腫瘤中胱氨酸水平是有限的。在腫瘤相關(guān)中培養(yǎng)細胞以胱氨酸時間和劑量依賴的方式增強了GOT1的下調(diào)（Fig. 2g）。胱氨酸對GOT1敲除小鼠PDA生長的影響與體外實驗結(jié)果一致?？傊?/span>GOT1抑制后，PDA培養(yǎng)物對外源性胱氨酸戒斷敏感。

圖2 GOT1抑制之后細胞活力和生長PDA離不開胱氨酸

3、抑制谷胱甘肽的生物合成可增強GOT1基因下調(diào)的生長抑制作用

谷胱甘肽（GSH）可以由半胱氨酸重新合成，也可以由氧化的谷胱甘肽(GSSG)經(jīng)NADPH還原再生（Fig. 3a）。GOT1抑制導(dǎo)致GSSG和NADP+增加，而GSH和NADPH隨細胞系而異。因此，作者推測抑制谷胱甘肽的生物合成可能增強GOT1敲除。GSH合成的限速步驟可以被BSO抑制。在24小時的藥物處理后，GOT1的抑制有效地增強了對BSO的敏感性，與單藥反應(yīng)溫和效應(yīng)相比，并且BSO暴露72 h會放大這增強作用（Fig. 3b, c）。抑制GOT1可增強BSO對增殖作用（Fig. 3d）。通過補充外源性GSH-EE或NAC可恢復(fù)上述對細胞活力的組合效應(yīng)（Fig. 3e），表明氧化還原失衡。GOT1敲除和BSO暴露對細胞的組合作用在小鼠體內(nèi)同樣適用（Fig. 3f, g）。總之，數(shù)據(jù)表明，在GOT1敲除的條件下，PDA需要谷胱甘肽的合成來維持生存和生長。

圖3在GOT1抑制下，PDA的生長需要谷胱甘肽的合成

4、GOT1抑制增強鐵死亡的敏感性

先前的研究表明，某些細胞類型對erastin和BSO敏感，這些藥物可以通過消耗GSH來殺死細胞。GSH消耗的近端效應(yīng)是通過GPX4活性的喪失介導(dǎo)的，GPX4利用GSH作為輔助因子來解毒脂質(zhì)過氧化物（Fig. 4a）。這可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的致命積累和鐵死亡。雖然GOT1抑制不能誘導(dǎo)鐵死亡，但本文的數(shù)據(jù)表明它可能為PDA細胞誘導(dǎo)鐵死亡。

為了研究GOT1是否能使PDA對鐵死亡敏感，首先檢測GOT1與RSL3的組合效應(yīng)，RSL3是GPX4的共價抑制劑和鐵死亡的直接誘導(dǎo)劑。RSL3聯(lián)合GOT1敲除比單獨使用更有效（Fig. 4b）。GOT1增強了一組PDA細胞系的鐵死亡，這種作用與dox效應(yīng)無關(guān)（Fig. 4c）。此外，RSL3聯(lián)合GOT1敲除顯著降低細胞增殖而增強了細胞毒性（Fig. 4d）。然后使用C11- BODIPY脂質(zhì)過氧化傳感器來研究GPX4和GOT1抑制如何影響脂質(zhì)過氧化。單獨抑制GOT1可導(dǎo)致適度的脂質(zhì)ROS，但與RSL3或erastin聯(lián)合使用可增強脂質(zhì)ROS的積累；這種增強作用可通過與親脂抗氧化劑鐵抑制素-1 (Fer-1)共同處理逆轉(zhuǎn)（Fig. 4e）。

隨后，作者檢測了GOT1對鐵死亡的作用是否可以通過與緩解脂質(zhì)過氧化或螯合鐵的藥物共同處理來抑制。與Fer-1聯(lián)合處理在可以抑制多個小分子的GOT1增強效應(yīng)，用親脂抗氧化劑，Trolox，或鐵螯合劑脫鐵胺(DFO)處理，可以為細胞提供顯著的保護作用（Fig. 4f）。為了排除凋亡、壞死或自噬細胞死亡機制的可能性，用這些細胞死亡途徑的特征明確的抑制劑共同抑制GOT1，結(jié)果顯示，與Trolox或DFO相比，這些抑制劑對細胞的保護作用非常有限?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，在細胞培養(yǎng)中，GOT1抑制啟動了PDA的鐵死亡。

圖4 GOT1抑制增強鐵死亡

5、GOT1抑制通過促進不穩(wěn)定鐵誘導(dǎo)PDA鐵死亡

研究表明代謝紊亂導(dǎo)致細胞內(nèi)儲存的鐵自適應(yīng)釋放，以支持線粒體的能量代謝?？紤]到鐵死亡的易感性與游離鐵的可得性有關(guān)，作者假設(shè)細胞內(nèi)鐵水平可能會隨著GOT1抑制介導(dǎo)的能量應(yīng)激而增加。作者通過測量Calcein-AM來驗證這一假設(shè)，Calcein-AM是一種熒光素衍生的探針，當(dāng)與亞鐵(Fe2+)結(jié)合時被淬滅。GOT1正常細胞的Calcein-AM染色確定基線熒光，GOT1基因敲除后，細胞熒光分布降低，表明活性鐵池增加（Fig. 5a）。在培養(yǎng)細胞中使用RhoNox-1鐵探針證實了這一觀察（Fig. 5b），在皮下和原位腫瘤中觀察到總鐵水平升高（Fig. 5c）。不穩(wěn)定鐵的影響在表型上很明顯，在GOT1缺乏的條件下，需要更高濃度的鐵螯合劑DFO來挽救細胞活力（Fig. 5d）。最后，補充檸檬酸鐵銨(FAC)可增強鐵死亡（Fig. 5e, f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GOT1敲低可促進不穩(wěn)定鐵，鐵會增強鐵死亡。

GOT1敲低可增強對FINO2（一種藥理性鐵氧化劑）的敏感性。通過下調(diào)鐵外流、上調(diào)鐵攝取或促進細胞內(nèi)鐵載體降解，可以改變鐵水平，即鐵蛋白(FTN)或血紅素。為了檢測這些途徑中哪一條導(dǎo)致細胞內(nèi)鐵增加，首先檢測了鐵運輸?shù)鞍椎谋磉_。GOT1敲低不改變鐵運輸?shù)鞍?/span>SLC40A1的表達。血紅素加氧酶1 (HMOX1)的表達在Pa-Tu-8902細胞中未發(fā)生改變，但在MIA PaCa-2中表達上調(diào)。GOT1敲低對NCOA4和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1影響最小。相比之下，IRP2水平較低，FTN水平較高，這兩種水平在高鐵負荷下均應(yīng)出現(xiàn)。Pa-Tu-8902細胞的轉(zhuǎn)錄組和基因集富集分析都揭示了分解途徑的特征通路“溶酶體”和“自噬-溶酶體”。與此一致，GOT1敲除增加了LC3-A/B II/I比值，降低了P62水平，與自噬通量的增加一致（Fig. 5g）。溶酶體抑制劑羥氯喹和Baf-A1說明，GOT1抑制增加自噬通量，而不是延緩自噬過程。

圖5 GOT1抑制促進不穩(wěn)定鐵釋放

總之，如Fig. 5i所示，抑制GOT1可抑制大量PDA細胞系、原發(fā)腫瘤模型和異種移植瘤的生長，同時使一些PDA細胞容易發(fā)生鐵死亡。抑制胱氨酸輸入、GSH合成或GPX4可與GOT1協(xié)同觸發(fā)鐵死亡。這種效應(yīng)可能是由于氧化還原破壞、線粒體抑制和適應(yīng)性不穩(wěn)定鐵釋放的聯(lián)合作用，所有這些都是已知的增強鐵死亡的因素。

參考文獻：

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