m6A調(diào)控的lncRNA LCAT3在肺癌中發(fā)揮致癌作用

lncRNA是重要的表觀遺傳調(diào)控因子，在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，lncRNA在肺癌發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。2021年7月發(fā)表于“Journal of Hematology & Oncology”（IF=17.388）的文章“LCAT3, a novel m6A?regulated long non?coding RNA, plays an oncogenic role in lung cancer via binding with FUBP1 to activate c?MYC”介紹了一種新的致癌lncRNA-LCAT3在肺癌發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制。我們通過(guò)分析TCGA中肺癌組織的RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了LCAT3。通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀來(lái)評(píng)估m6A對(duì)LCAT3的修飾。LCAT3-FUBP1-MYC軸通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告、RNA免疫沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)被評(píng)估。利用RNA-seq技術(shù)鑒定了LCAT3基因敲低改變的信號(hào)通路。此外，通過(guò)體內(nèi)和體外的功能喪失和功能獲得試驗(yàn)，研究了LCAT3的作用機(jī)制。結(jié)果表明，LCAT3在肺腺癌(LUAD)中表達(dá)上調(diào)，其過(guò)表達(dá)與LUAD患者的不良預(yù)后相關(guān)。LCAT3上調(diào)可歸因于甲基轉(zhuǎn)移酶3 （METTTL3）介導(dǎo)的m6A修飾，導(dǎo)致LCAT3穩(wěn)定。生物學(xué)上，功能缺失分析顯示，在體外，LCAT3敲低顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。LCAT3敲低誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期。在機(jī)制上，LCAT3將FUBP1招募到MYC的FUSE序列上從而激活MYC轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果：

1）LCAT3在肺癌中上調(diào)，與預(yù)后不良呈正相關(guān)

在本研究中，我們研究了一種新的lncRNA，命名為LCAT3。TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，與相鄰正常組織相比，LCAT3在LUAD組織中顯著上調(diào)(圖1A)。我們進(jìn)一步用qRT-PCR驗(yàn)證了LCAT3在13對(duì)肺癌樣本和相應(yīng)的非癌肺樣本中的表達(dá)。與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，qRT-PCR結(jié)果證實(shí)LCAT3在肺癌組織中上調(diào)(圖1B)。重要的是，Kaplan-Meier生存分析顯示，LCAT3表達(dá)水平較高的LUAD患者總生存期和無(wú)病生存期均短于LCAT3表達(dá)水平較低的LUAD患者(圖1C, D)。采用CPAT和CPC2計(jì)算LCAT3蛋白編碼能力。LCAT3編碼蛋白質(zhì)的潛力低于其他經(jīng)典的lncRNA，如XIST和HOTAIR(圖1E, F)，表明LCAT3最有可能是一種lncRNA。亞細(xì)胞定位分析顯示，LCAT3分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖1G, H)。

2）METTTL3是肺癌中LCAT3上調(diào)的原因

m6A修飾是mRNA和lncRNA最普遍的轉(zhuǎn)錄后修飾，并調(diào)節(jié)其翻譯、穩(wěn)定性等。我們的生物信息學(xué)分析顯示，核心m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTTL3確實(shí)在LUAD中上調(diào)(圖2A)。因此，我們使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除肺癌細(xì)胞中的METTTL3，western bolt證實(shí)了敲除效率(圖2B)。我們發(fā)現(xiàn)METTTL3的耗竭明顯降低LCAT3表達(dá)水平(圖2C, D)。此外，MeRIP-seq顯示在A549細(xì)胞中，LCAT3上m6A修飾富集，METTL3敲除后m6A水平降低(圖2E)。隨后MeRIP-qPCR證實(shí)METTL3敲除顯著降低了LCAT3 m6A修飾水平(圖2F)。最后，我們用放線(xiàn)菌素D處理肺癌細(xì)胞以阻斷轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)METTTL3敲低顯著降低LCTA3轉(zhuǎn)錄本的半衰期(圖2G, H)?？傊?，METTTL3介導(dǎo)的m6A似乎是LUAD中LCAT3上調(diào)的原因，可能是通過(guò)穩(wěn)定其轉(zhuǎn)錄本。

3）LCAT3在體內(nèi)和體外均可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖

為了研究LCAT3在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們使用siRNA沉默了Calu1和Hop62肺癌細(xì)胞中的LCAT3，這充分降低了LCAT3的表達(dá)(圖3A)。CCK-8檢測(cè)顯示，LCAT3沉默后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制(圖3B)。同樣，集落形成分析也顯示，與siRNA-NC相比，LCAT3敲除可顯著減少細(xì)胞集落(圖3C, D)。此外，EdU分析顯示，LCAT3敲除可顯著減少肺癌細(xì)胞中的DNA復(fù)制(圖3E, F)。為了進(jìn)一步評(píng)估LCAT3在體內(nèi)的致癌作用，我們用shRNA穩(wěn)定敲除Calu1和Hop62細(xì)胞中的LCAT3，并通過(guò)皮下注射建立移植瘤小鼠模型(圖3G)。與shRNA NC組相比，LCAT3敲低組的腫瘤體積和腫瘤重量顯著降低(圖3H, I)。總體而言，LCAT3對(duì)體外和體內(nèi)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存都至關(guān)重要。

4）LCAT3對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞周期進(jìn)展的影響

我們探討了LCAT3對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。Transwell分析顯示，LCAT3敲低抑制了Calu1和Hop62細(xì)胞的遷移和侵襲(圖4A, B)。為了探究LCAT3是否也在體內(nèi)調(diào)節(jié)肺癌轉(zhuǎn)移，我們將熒光素標(biāo)記的對(duì)照或LCAT3沉默的Calu1細(xì)胞靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，然后每周對(duì)裸鼠進(jìn)行一次生物發(fā)光成像(BLI)。持續(xù)的BLI監(jiān)測(cè)顯示，4周后注射LCAT3沉默的Calu1細(xì)胞的小鼠肺部轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)顯著下降(圖4C, D)。為確定LCAT3基因敲除是否影響肺癌細(xì)胞周期，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LCAT3基因敲除和NC肺癌細(xì)胞。LCAT3敲低導(dǎo)致G1阻滯(圖4E, F)。Western blot檢測(cè)證實(shí)，一些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如cyclin A2, cyclin B1和cyclin D1在LCAT3敲低后明顯下調(diào)(圖4G)。為了進(jìn)一步分析LCAT3對(duì)肺癌的影響，我們對(duì)LCAT3敲除的肺癌細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq。KEGG通路和GO富集分析顯示最顯著的KEGG通路和GO項(xiàng)是與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂相關(guān)的，這表明LCAT3沉默導(dǎo)致了細(xì)胞周期調(diào)控基因的顯著改變(圖4H, I)。

5）LCAT3與FUBP1發(fā)生物理作用，FUBP1在LUAD中也過(guò)表達(dá)

為了闡明LCAT3在肺癌細(xì)胞中作用的潛在分子機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA下拉試驗(yàn)來(lái)鑒定LCAT3結(jié)合蛋白。從凝膠中剪切LCAT3義和反義之間的明顯波段用于質(zhì)譜分析(圖5A)。FUBP1因其與LCAT3的特異性結(jié)合而被選擇進(jìn)行進(jìn)一步研究(圖5B)。此外，采用抗FUBP1抗體進(jìn)行RIP檢測(cè)，進(jìn)一步證明FUBP1與LCAT3之間的相互作用(圖5C)。與FUBP1結(jié)合的核心序列為LCAT3的208-342 nt，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，我們使用LCAT3的208-342 nt片段進(jìn)行RNA拉下分析。結(jié)果證實(shí)該莖環(huán)區(qū)(208-342 nt)確實(shí)負(fù)責(zé)LCAT3和FUBP1之間的結(jié)合(圖5D)。前人研究表明，FUBP1可以分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是抑制結(jié)構(gòu)域、DNA和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域。因此，我們構(gòu)建了flag標(biāo)記的全長(zhǎng)野生型FUBP1突變體的類(lèi)型和三個(gè)缺失域突變體(圖5E)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，LCAT3主要結(jié)合于DNA和RNA結(jié)合區(qū)域(100-447aa)(圖5F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LCAT3與FUBP1發(fā)生物理作用，LCAT3的莖環(huán)區(qū)(208-342 nt)和FUBP1的DNA和RNA結(jié)合域(100-447aa)是LCAT3與FUBP1結(jié)合所必需的。此外，我們發(fā)現(xiàn)，FUBP1的mRNA和蛋白水平在LUAD中均顯著上調(diào)(圖5G, H)，且在肺癌患者中，FUBP1的高表達(dá)與較短的生存時(shí)間相關(guān)(圖5I)。

6）FUBP1沉默可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和存活

FUBP1在LUAD中的生物學(xué)功能尚未被報(bào)道，因此，我們通過(guò)siRNA敲除A549和Calu1細(xì)胞中的FUBP1來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞表型的潛在變化。在FUBP1敲低(圖6A, B)時(shí)，我們觀察到肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖6C)和菌落存活(圖6D)受到顯著抑制。此外，與LCAT3敲低一樣，FUBP1敲低也抑制A549和Calu1肺癌細(xì)胞的遷移(圖6E, F)，并通過(guò)顯著降低cyclin A2和cyclin D1水平觸發(fā)G1阻滯(圖6H, I)(圖6G)?？偟膩?lái)說(shuō)，FUBP1通過(guò)增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的惡性表型發(fā)揮致癌作用。

7）LCAT3和FUBP1共同調(diào)控c-Myc的表達(dá)

我們假設(shè)LCAT3將與FUBP1合作調(diào)節(jié)MYC表達(dá)。結(jié)果表明，FUBP1的敲除顯著抑制了c-MYC mRNA和蛋白質(zhì)的水平(圖7 A, B)。 LCAT3敲除也顯著降低c-MYC mRNA和蛋白的水平在A549和Calu1細(xì)胞(圖7C, D)。因此，與FUBP1一樣，LCAT3也是一個(gè)c-MYC陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子。有趣的是，雖然LCAT3或FUBP1的敲低降低了c-MYC的水平，但同時(shí)敲低LCAT3和FUBP1并不能進(jìn)一步降低c-MYC的水平(圖7E, F)，這表明LCAT3和FUBP1在同一調(diào)控點(diǎn)調(diào)控c-MYC的表達(dá)。

8）LCAT3招募FUBP1激活MYC轉(zhuǎn)錄

芯片分析表明，FUBP1在肺癌細(xì)胞中與c-MYC啟動(dòng)子結(jié)合(圖8A)。FUBP1在LCAT3敲低后顯著降低(圖8 B, C)。因此，LCAT3似乎是FUBP1與c-MYC啟動(dòng)子結(jié)合所必需的。然后，然后，我們測(cè)試了LCAT3是否通過(guò)將FUBP1招募到c-MYC啟動(dòng)子上的FUSE序列中來(lái)激活c-MYC表達(dá)。使用c-MYC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因，在有或沒(méi)有FUSE序列的情況下(圖8D)，我們發(fā)現(xiàn)LCAT3或FUBP1基因敲低后，c-MYC啟動(dòng)子活性受到抑制，這種抑制方式依賴(lài)于FUSE序列(圖8E, F)。因此，LCAT3將FUBP1招募到MYC FUSE序列中來(lái)激活其轉(zhuǎn)錄。

結(jié)論：我們鑒定并表征了肺癌中m6A調(diào)控的新lncRNA -LCAT3。METTTL3通過(guò)m6A修飾穩(wěn)定LCAT3。過(guò)表達(dá)的LCAT3將FUBP1招募到c-MYC啟動(dòng)子上，以激活c-MYC表達(dá)，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞增殖、存活、遷移/侵襲和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。我們的研究揭示了LCAT3-FUBP1-cMYC軸的致癌作用，并將其描述為一個(gè)有前景的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的肺癌治療靶點(diǎn)。