YTHDF1通過控制FZD7的翻譯促進(jìn)胃癌發(fā)生

N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核mRNA中最豐富的形式。RNA m6A在植物、脊椎動物中高度保守，并且在病毒以及古細(xì)菌、細(xì)菌和酵母等單細(xì)胞生物中也觀察到。m6A相關(guān)基因的缺陷會影響不同的生物過程。然而，如何m6A調(diào)節(jié)致癌作用以及下游途徑和機(jī)制如何傳遞這些信號尚未完全了解。今天我們講一篇胃癌m6A的研究，文章題名為：YTHDF1 Promotes Gastric Carcinogenesis by Controlling Translation of FZD7，該文章刊登在Cancer Research期刊（IF=12.7）.

YTHDF1基因在胃癌中的擴(kuò)增

為了探究參與胃癌發(fā)展的m6A相關(guān)基因的遺傳改變，分析了包含630種原發(fā)性胃腺癌的cBioPortal數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)。值得注意的是，YTH家族讀取器顯示出相對較高的突變率。YTHDF1是最普遍的突變基因，發(fā)生在約7%的胃癌患者中。通過評估YTHDF1突變的分布，觀察到所有突變中有65%是基因擴(kuò)增，這通常導(dǎo)致基因產(chǎn)物的過度表達(dá)。然后探索了TCGA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)胃癌患者中YTHDF1 的表達(dá)確實(shí)顯著高于正常組織。此外，YTHDF1突變在多種癌癥中并不常見，但在大多數(shù)腫瘤中觀察到YTHDF1的上調(diào)，表明YTHDF1在癌癥發(fā)展中具有普遍的致癌作用。特別是，較高的YTHDF1表達(dá)與胃癌進(jìn)展和較差的總生存期相關(guān)。

接下來通過qPCR在113對內(nèi)部胃癌組織和匹配的癌旁組織中驗(yàn)證，YTHDF1 mRNA在胃癌腫瘤中顯著增加。對正常胃組織和胃癌標(biāo)本的IHC分析證實(shí)了腫瘤組織中 YTHDF1 蛋白的上調(diào)。此外，胃癌患者中YTHDF1的異常高表達(dá)與更嚴(yán)重的臨床病理特征顯著相關(guān)，例如神經(jīng)周圍浸潤、侵襲性腫瘤分期和靜脈浸潤。Kaplan-Meier生存分析還表明，具有高YTHDF1表達(dá)的胃癌患者的 4年總生存率較差。這些數(shù)據(jù)共同表明YTHDF1在胃腫瘤發(fā)生中的潛在致癌作用。

YTHDF1缺陷抑制胃癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

測量各種胃癌細(xì)胞系中YTHDF1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，其遠(yuǎn)高于正常胃腺細(xì)胞GES-1。為了進(jìn)一步探索YTHDF1在胃癌中的功能，應(yīng)用了不同的系統(tǒng)，包括胃癌細(xì)胞系、細(xì)胞系衍生的異種移植物 (CDX) 和 PDX 模型。首先，通過產(chǎn)生兩種穩(wěn)定的shRNA敲低人胃癌細(xì)胞系MGC-803和HGC-27中YTHDF1，它們在所有測試的胃癌細(xì)胞系中顯示出相對較高的YTHDF1表達(dá)。YTHDF1敲低確實(shí)降低了胃癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。此外，MGC-803和HGC-27細(xì)胞中的YTHDF1 缺失削弱了它們的遷移和侵襲能力。接下來通過將缺乏YTHDF1的MGC-803細(xì)胞皮下注射到裸鼠中，檢查了YTHDF1敲低是否會影響體內(nèi)胃癌的發(fā)生。一致地，YTHDF1水平降低導(dǎo)致MGC-803移植腫瘤的腫瘤進(jìn)展延遲，YTHDF1敲低的腫瘤重量和體積顯著降低。因此，在敲低YTHDF1的腫瘤中，增殖標(biāo)志物Ki-67下調(diào)，凋亡標(biāo)志物cleaved caspase-3上調(diào)。

然后，探討了YTHDF1是否有助于體內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移。尾靜脈注射YTHDF1過表達(dá)MGC-803細(xì)胞導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移，而YTHDF1的敲低幾乎完全消除了轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)形成。在腹膜轉(zhuǎn)移性異種移植模型中，注射缺乏YTHDF1的MGC-80 細(xì)胞也顯著減少了腹腔中的繼發(fā)性腫瘤形成。所有這些結(jié)果都證實(shí)了 YTHDF1 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移在胃癌發(fā)生中的致癌作用。為了進(jìn)一步證實(shí)體內(nèi)和體外研究得出的結(jié)論，建立了PDX模型，結(jié)果表明，敲除YTHDF1抑制了腫瘤生長和重量。此外，與siControl腫瘤相比，siYTHDF1治療的腫瘤中Ki-67表達(dá)顯著降低，而 siYTHDF1腫瘤中裂解的caspase-3顯著增加。這些數(shù)據(jù)還揭示了YTHDF1在胃癌腫瘤發(fā)生中起重要作用。

通過RNA-seq、RIP-seq和MeRIP-seq鑒定YTHDF1調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本

為了全面了解YTHDF1缺陷對胃癌發(fā)展的影響，對YTHDF1敲低和對照 MGC-803細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq分析。RNA 分析揭示了在YTHDF1抑制后失調(diào)的不同轉(zhuǎn)錄本子集。GO分析表明，這些下調(diào)的基因富集了血管生成、細(xì)胞遷移、粘附和細(xì)胞生長；而映射到負(fù)調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的基因被上調(diào)，即YTHDF1是胃癌的致癌因子。接下來通過在 MGC-803細(xì)胞中使用 RIP-seq 篩選 YTHDF1 結(jié)合基因。獲得了9082個候選基因。分析了前3000個最顯著的功能富集基因，表明它們高度參與了癌癥相關(guān)通路。然而，累積分布分析表明YTHDF1結(jié)合基因和 YTHDF1未結(jié)合基因在轉(zhuǎn)錄水平上沒有顯著差異。這與之前YTHDF1主要調(diào)節(jié)基因翻譯的發(fā)現(xiàn)一致。

YTHDF1是眾所周知的m6A特異性讀取蛋白，因此在 MGC-803 細(xì)胞內(nèi)使用MeRIP-seq鑒定受YTHDF1調(diào)節(jié)的具有m6A修飾的潛在轉(zhuǎn)錄物。2365個轉(zhuǎn)錄物檢測到m6A修飾，主要發(fā)生在 mRNA 中，優(yōu)先聚集在外顯子中。與其他N6-甲基腺苷測序結(jié)果一致，m6A峰在3'UTR 區(qū)域富集，并且僅用典型的 GGAC 基序檢測到。

為了搜索YTHDF1的直接目標(biāo)，將YTHDF1特異性RIP-seq和MeRIP-seq 鑒定的轉(zhuǎn)錄本重疊。對這些轉(zhuǎn)錄物的富集分析顯示Wnt和Hippo信號通路受到顯著影響，這兩種通路都被證明對腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要，并且在各種癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變，因此假設(shè)YTHDF1抑制通過Hippo或Wnt途徑抑制腫瘤生長。

FZD7 是 YTHDF1 真正的 m6A 修飾目標(biāo)

分配給Hippo或Wnt通路的總共13個轉(zhuǎn)錄本。為了驗(yàn)證胃癌中真正的 YTHDF1靶標(biāo)，采用了多步驟篩選策略。首先，使用RIP結(jié)合qPCR驗(yàn)證確定YTHDF1 相互作用的轉(zhuǎn)錄本。包括FZD1、FZD7、CTBP2、MAPK9和MAP3K7屬于Wnt 通路的轉(zhuǎn)錄本，以及屬于Hippo通路的TP53BP1、PARD3、SMAD2和SMAD3都被YTHDF1抗體特異性地有效免疫沉淀。鑒于YTHDF1可以在翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的概念，隨后檢測了這些候選基因在YTHDF1缺陷細(xì)胞中的表達(dá)。YTHDF1 敲低僅顯著降低了FZD7、MAPK9、SMAD2、SMAD3 和 PARD3 的蛋白質(zhì)水平，它們的mRNA 沒有受到影響。

此外，m6A 免疫沉淀（m6A-RIP）和YTHDF1增強(qiáng)的交聯(lián)免疫沉淀（eCLIP）和qPCR證實(shí)了m6A修飾的存在FZD、MAPK9、SMAD2、SMAD3和PARD3 mRNA的占用。接下來，進(jìn)行了polysome分析，這種方法可以監(jiān)測特定 mRNA 的翻譯活性，以驗(yàn)證YTHDF1是否可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中候選物的翻譯。正如預(yù)期的那樣，YTHDF1敲低顯示出普遍的翻譯抑制，因?yàn)?/span>YTHDF1缺陷的MGC-803細(xì)胞中的多核糖體關(guān)聯(lián)逐漸減少。值得注意的是，FZD7的翻譯效率是最顯著下調(diào)的，而其他基因表現(xiàn)出輕微的翻譯抑制。綜上所述，這些結(jié)果共同表明 FZD7是YTHDF1在胃癌中的真正直接靶點(diǎn)。

YTHDF1以m6A依賴性方式調(diào)節(jié)FZD7表達(dá)

眾所周知，FZD7作為一個特征明確的致癌基因，在胃癌患者中被激活以促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。為了驗(yàn)證之前的發(fā)現(xiàn)，除了MGC-803之外，另一種胃癌細(xì)胞系HGC-27分別用于基因特異性m6A-qPCR 和YTHDF1 RIP-qPCR 分析。事實(shí)上，在FZD7 mRNA中觀察到兩個m6A峰，并且在MGC-803和HGC-2 細(xì)胞中都證實(shí)了與YTHDF1的關(guān)聯(lián)。

   然后YTHDF1調(diào)節(jié)的FZD7翻譯是否依賴于m6A修飾。為了解決這個問題，將帶有兩個關(guān)鍵氨基酸突變（K395A、Y397A）以消除其m6A結(jié)合域的Flag標(biāo)記突變體YTHDF1構(gòu)建體（YTHDF1-MUT）轉(zhuǎn)染到MGC-803和HGC-27中細(xì)胞。引入這些突變后，由于m6A閱讀器活性缺陷，在野生型YTHDF1 (YTHDF1-WT) 轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞中觀察到的FZD7表達(dá)上調(diào)在 YTHDF1-MUT 中被消除（，但mRNA水平在兩種細(xì)胞系中，YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT之間的FZD7 相當(dāng)。因此，RIP-qPCR分析顯示FZD7 mRNA 與突變體YTHDF之間的相互作用明顯受損。

為了進(jìn)一步探索FZD7 mRNA中 m 6 A 修飾的參與，構(gòu)建了三種類型的FZD7突變體，在第一個 (FZD7-Peak1 Mut) 或第二個 (FZD7-Peak2 Mut) m6A 峰以及雙突變體（FZD7-Peak1&2 Mut）。有趣的是，與野生型 FZD7 (FZD7-WT) 相比，第二個m6A峰內(nèi)的突變和雙m6A 峰突變體對野生型YTHDF1沒有反應(yīng)過表達(dá)，表明FZD7 中的第二 m6A峰是YTHDF1調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)。再次，損失 m6A 結(jié)合能力完全消除了YTHDF1在促進(jìn)FZD7 mRNA翻譯中的作用。這些結(jié)果表明YTHDF1介導(dǎo)的FZD7的翻譯控制依賴于m6A修飾。

YTHDF1通過FZD7調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路

在Wnt配體與受體結(jié)合后，β-catenin被穩(wěn)定并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中（激活形式），在那里它與其他共激活因子相互作用以激活下游基因轉(zhuǎn)錄。因?yàn)?/span>FZD7可以激活胃癌細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)并且YTHDF1是FZD7表達(dá)的正調(diào)節(jié)因子，假設(shè)YTHDF1可以直接調(diào)節(jié)Wnt通路。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，分別檢查了總β-catenin和活化β-catenin。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)敲除YTHDF1后FZD7表達(dá)被抑制時，還觀察到MGC-803和HGC-27細(xì)胞中總和活化的β-catenin的表達(dá)降低。此外，只有野生型YTHDF1，而不是突變型，在胃癌細(xì)胞中增加FZD7并激活β-catenin表達(dá)，表明YTHDF1以m6A依賴性方式激活β-catenin。使用 IF 染色，觀察到過表達(dá)野生型YTHDF1而不是突變形式的胃癌細(xì)胞顯示出更強(qiáng)烈和累積的 β-catenin染色。相反，與對照細(xì)胞相比，YTHDF1 敲低細(xì)胞顯示出較少的 β-catenin積累。一致地，Wnt/β-catenin 途徑的其他六個已知下游參與者，包括HMGA2、CNCD1、CDC25A、COX2、SOX9和 VEGFA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上以與β-catenin 相似的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，即在野生型而非突變型YTHDF 過表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)，而在 YTHDF1 敲低細(xì)胞中下調(diào)。此外，在來自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫的胃癌數(shù)據(jù)集中，YTHDF1水平與這些β-catenin靶標(biāo)的表達(dá)之間也存在很強(qiáng)的相關(guān)性。綜上所述，這些結(jié)果表明YTHDF1可以激活胃癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 通路，該通路由 FZD7的翻譯控制介導(dǎo)，FZD7 是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵受體。

YTHDF1-FZD7-β-catenin軸有助于胃腫瘤發(fā)生

在YTHDF1刺激FZD7-β-catenin通路激活的發(fā)現(xiàn)的推動下，β-catenin激活是否可以挽救在YTHDF1缺陷型胃癌細(xì)胞中觀察到的延遲腫瘤進(jìn)展表型。因此，使用了兩種不同的方法，通過過表達(dá)FZD7或通過用特定激動劑 SKL2001（刺激β-catenin，這可以破壞降解復(fù)合物并穩(wěn)定β- catenin。與之前的發(fā)現(xiàn)類似，FZD7 的過表達(dá)或激活β-catenin都增加了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲在YTHDF1感受態(tài)的 MGC803和HGC-27細(xì)胞中。此外，在YTHDF1敲低細(xì)胞中FZD7過表達(dá)或 SLK2001處理可以將受損的惡性表型重建到與YTHDF1感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃健?。總之?/span>β-catenin 通路的遺傳或藥理學(xué)激活可以挽救YTHDF1缺陷引起的增殖、遷移和侵襲減少。

為了進(jìn)一步研究患者的胃腫瘤組織中是否發(fā)生蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，對79對內(nèi)部人胃癌樣本進(jìn)行了IHC芯片分析，并對18對胃癌組織及其鄰近正常組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。正如預(yù)期的那樣，YTHDF1，FZD7和活化的β-catenin在人胃腫瘤顯示出相似的上調(diào)時與相鄰的正常組織，這在PDX 數(shù)據(jù)集中證實(shí)，抑制YTHDF1也抑制了FZD7和β-catenin的活性。此外，Kaplan-Meier生存分析還表明，具有高YTHDF1、FZD7、β-catenin表達(dá)的胃癌患者的總生存期較差，表明胃腫瘤中YTHDF1、FZD7 和活化β-catenin的同步變化代表了可靠的預(yù)后指標(biāo)。β-catenin在正常胃粘膜中由蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)嚴(yán)格維持。然而，在胃癌細(xì)胞中，升高的YTHDF1激活FZD7的翻譯和表達(dá)，從而刺激β-catenin并易位至細(xì)胞核以激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，數(shù)據(jù)揭示了一種新的 YTHDF1-FZD7-β-catenin軸，該軸對于調(diào)節(jié)胃癌發(fā)展中的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。