多組學(xué)文章借鑒—— 抗生素誘導(dǎo)的微生物組失調(diào)通過改變代謝物促進(jìn)脂質(zhì)合成

闡明脂質(zhì)生成和脂肪沉積的機(jī)制對(duì)控制雞脂肪過度沉積至關(guān)重要。研究表明腸道微生物在調(diào)控宿主脂質(zhì)生成和脂類代謝中發(fā)揮了重要作用。但是，我們對(duì)腸道微生物在雞的脂類代謝及其相關(guān)機(jī)制中的了解非常少。本文作者通過口服抗生素后使用16S rRNA測(cè)序聯(lián)合UHPLC–MS/MS分析初步揭示了該過程中關(guān)鍵微生物和代謝物改變過程。本文于2021年7月28日發(fā)表在《metabolites》IF：4.932期刊上。

技術(shù)路線如下：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1、抗生素處理促進(jìn)雞的脂質(zhì)生成

如圖1A所示，在抗生素處理3周后，與對(duì)照組相比，雞的體重(BW)、腹脂體重(AFW)、腹脂率(AFR)均顯著增高；血清甘油三酯(STG)、高密度脂蛋白(SHDL)、低密度脂蛋白(SLDL)、肝甘油三酯(TG)水平也都顯著升高；血清總膽固醇(STC)含量差異不顯著，表明抗生素處理可顯著促進(jìn)雞的脂肪生成。

圖1A抗生素處理對(duì)雞脂質(zhì)生成的影響

2、抗生素處理改變腸道微生物組

在10個(gè)樣本中總計(jì)鑒定到959個(gè)OTUs。16S測(cè)序的結(jié)果中，抗生素處理組的微生物群落多樣性顯著下降，這從observed_species (Sob)、abundance-based coverage estimators (ACE)、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)可以看出(圖1B)。提示抗生素處理降低了雞盲腸菌群的豐富度和均勻度。Rank豐度曲線也顯示了豐富度和均勻度的下降(圖1C)。beta多樣性分析顯示，抗生素組與對(duì)照組顯著分離(圖1D-E)。之后，在門和屬水平分析微生物種群變化情況，如圖1F和2A所示，在門水平上，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(45.4%)和擬桿菌門(43.7%)，但在抗生素處理后，它們的豐度都顯著下降，而Proteobacteria豐度顯著增加，其也是抗生素處理組的優(yōu)勢(shì)菌群（90.4%）。在屬水平（圖1F和2B），Bacteroides是對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌群，但抗生素素處理后其優(yōu)勢(shì)被消除，而Escherichia-Shigella和Klebsiella菌急劇增加，成為抗生素組的優(yōu)勢(shì)菌群?？傊?，口服抗生素顯著改變了雞盲腸微生物組。

圖1B-F抗生素處理對(duì)雞盲腸微生物組的影響

3、抗生素處理改變盲腸代謝組

總計(jì)檢測(cè)到19037個(gè)代謝物峰，包括9907個(gè)陽離子峰和9130個(gè)陰離子峰。PCA分析和熱圖分析基于所有的峰，結(jié)果顯示對(duì)照組和NFD-1出離與實(shí)驗(yàn)中因而在后續(xù)分析這被剔除，并且可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)中顯著分離，表明抗生素處理顯著改變了盲腸代謝組。

圖2 抗生素處理對(duì)盲腸代謝組和微生物組的影響

4、鑒定差異分類群

如圖3所示，作者在門水平和屬水平展示了對(duì)照組（NFD）和抗生素組（NFDA）的差異菌群。門水平，抗生素組包括Proteobacteria顯著增加，Frimicutes，Bacteroidetes和Actinobacteria顯著下降。在屬水平則鑒定到15個(gè)顯著改變的菌群，但是只有3個(gè)是在抗生素組顯著增加，包括Escherichia-Shigella，Klebsiella和Proteus，其余的12個(gè)則都顯著下降，如Bacteroides和Alistips。

圖3對(duì)照組和抗生素處理組間在門和屬水平上的差異分類群

5、預(yù)測(cè)盲腸微生物群的功能

如圖4所示，使用Tax4Fun預(yù)測(cè)微生物群的功能，結(jié)果顯示碳代謝和脂質(zhì)代謝相關(guān)菌群顯著富集，而氨基酸代謝和核苷酸代謝相關(guān)菌群在抗生素處理后丟失。

圖4預(yù)測(cè)盲腸微生物群的功能

6、差異代謝物的鑒定和功能分析

總計(jì)鑒定到1744個(gè)差異代謝物，其中799個(gè)代謝物顯著富集，而945個(gè)代謝物被刪除以響應(yīng)抗生素處理（圖5A, B）。KEGG顯示1744個(gè)差異代謝物被注釋到23個(gè)代謝途徑，其中有15個(gè)是代謝相關(guān)途徑如氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝（圖5C）。

圖5差異代謝物的鑒定和功能分析

7、盲腸微生物組和雞脂質(zhì)生成相關(guān)

為了探究盲腸微生物組變化和雞脂質(zhì)合成的關(guān)聯(lián)，作者分析了種群豐度矩陣（門和屬水平）和脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。如圖6A所示，在門水平，盲腸微生物組和AFR，STG，SHDL，SKDK和KTG顯著相關(guān)。在屬水平，盲腸微生物組和AFW，AFR，BW，LTG，STG，SHDL和SLDL顯著相關(guān)。

作者計(jì)算了不同分類群（門和屬水平）和脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)以進(jìn)一步探究盲腸微生物組和雞脂質(zhì)生成的關(guān)系。如圖6B所示，在門水平，Proteobacteria豐度和所有脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)正相關(guān)除了STC，Frimicutes，Bacteroidetes和Actinobacteria和大多數(shù)脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)負(fù)相關(guān)；在屬水平，Escherichia-Shigella豐度和所有脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)正相關(guān)，Klebsiella豐度和所有脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)正相關(guān)除了STC，Proteus豐度和BW，AFW，AFR，STG和STC正相關(guān)。相反地，屬水平的余下12個(gè)菌群，和大多數(shù)脂質(zhì)合成指標(biāo)負(fù)相關(guān)（圖6C）。

圖6盲腸微生物組和雞脂質(zhì)生成相關(guān)

8、微生物組和代謝組聯(lián)合分析

為了探究是否改變的腸道微生物組可以調(diào)節(jié)雞的脂質(zhì)合成通過影響盲腸代謝物，作者對(duì)差異菌群和代謝物進(jìn)行了聯(lián)合分析。在門水平，4個(gè)差異菌群與244個(gè)差異代謝物顯著相關(guān)，如圖7所示，Proteobacteria門和103個(gè)差異代謝物正相關(guān)，和10個(gè)差異代謝物負(fù)相關(guān)。Bacteroidetes分別和93個(gè)和5個(gè)差異代謝物正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。Frimicutes分別和110個(gè)和6個(gè)差異代謝物正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。Actinobacteria分別和103個(gè)和11個(gè)差異代謝物正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

圖7門水平差異菌群和差異代謝物的相關(guān)性分析

在屬水平，15個(gè)差異菌群和304個(gè)差異代謝物顯著相關(guān)，其中，如圖8所示，三個(gè)在抗生素處理后顯著富集的菌群，包括Escherichia-Shigella，Klebsiella和Proteus和194個(gè)代謝物正相關(guān)20和代謝物負(fù)相關(guān)。余下12個(gè)代謝物和238個(gè)差異代謝物正相關(guān)，和60個(gè)差異代謝物負(fù)相關(guān)（圖9）。

圖8屬水平Escherichia-Shigella，Klebsiella和Proteus和差異代謝物的相關(guān)性

圖9屬水平在抗生素處理后顯著減少的12個(gè)菌群與差異代謝物的相關(guān)性

9、網(wǎng)絡(luò)圖中代謝物的集富集分析

為了鑒定鏈接雞盲腸微生物群與脂質(zhì)生成之間的代謝物，進(jìn)行了代謝物富集分析。在門水平，有三個(gè)代謝物集顯著富集，包括obesity，myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome和unclassified Ibd （圖10A）。有4個(gè)代謝物在屬水平顯著富集，包括unclassified Ibd，encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome，gout和obesity（圖10B）。很顯然，肥胖代謝物集在門水平和屬水平均顯著富集。肥胖代謝物集涉及三種差異代謝物：L-glutamic acid，pantothenic acid， N-acetyl-L-aspartic acid。L-glutamic acid和pantothenic acid豐度在抗生素處理后顯著增加，并與Proteobacteria門和Escherichia-Shigella屬的豐度呈極顯著正相關(guān)，和Klebsiella屬的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（圖10C-E）。L-glutamic acid豐度和Proteus屬呈極顯著正相關(guān)（圖10D）。

圖10鑒定可以連接盲腸微生物組和脂質(zhì)合成的關(guān)鍵代謝物

參考文獻(xiàn)：

Zhang Tao., Ding Hao., Chen Lan., Lin Yueyue., Gong Yongshuang., Pan Zhiming., Zhang Genxi., Xie Kaizhou., Dai Guojun., Wang Jinyu.(2021). Antibiotic-Induced Dysbiosis of Microbiota Promotes Chicken Lipogenesis by Altering Metabolomics in the Cecum. Metabolites, 11(8), undefined. doi:10.3390/metabo11080487