外泌體傳輸?shù)膍iRNA-335-5p通過(guò)靶向RASA1促進(jìn)EMT以促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌 (CRC) 在世界范圍內(nèi)普遍存在，其死亡率主要是由于其轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的關(guān)鍵器官而造成的。外泌體-microRNA（miRNA）分泌已被表征為癌細(xì)胞間細(xì)胞間通訊的重要因素。 然而，癌癥分泌的 miRNA 與結(jié)直腸癌 (CRC) 轉(zhuǎn)移的特異性相關(guān)知之甚少。因此了解 CRC 轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制對(duì)于確定新的診斷生物標(biāo)志物和制定 CRC 患者的治療策略非常重要。目前，有作者對(duì)這一機(jī)制進(jìn)行了研究，該研究于2021年6月發(fā)表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》，IF：8.886。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1. CRC 細(xì)胞外泌體的表征

作者分離從CRC 細(xì)胞表面脫落的各種囊泡，通過(guò)電子顯微鏡、納米顆粒大小電位分析和蛋白質(zhì)印跡鑒定外泌體（圖1A-1C）。為了確定外泌體是否可以被 CRC 細(xì)胞內(nèi)化，用熒光染料 PKH67 標(biāo)記外泌體，然后將它們與 SW480 細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示 SW480 細(xì)胞表現(xiàn)出高吸收效率（圖1D）。與 PKH67 標(biāo)記的外泌體孵育 24 小時(shí)后，超過(guò) 90% 的 SW480 細(xì)胞對(duì) PKH67 熒光呈陽(yáng)性，表明外泌體被 SW480 細(xì)胞內(nèi)化。

圖1 來(lái)自結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞系的外泌體的特性

2. 轉(zhuǎn)移性CRC SW620細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT

作者使用細(xì)胞系 SW480 和 SW620 作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)CCK-8 在 24 小時(shí)、48 小時(shí)和 72 小時(shí)測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果表明，SW480-exo 或 SW620-exo 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響（圖 2A）。此外，平板集落形成分析顯示 SW480-exo 或 SW620-exo 細(xì)胞之間的生長(zhǎng)沒(méi)有差異（圖 2B）。然而，來(lái)自轉(zhuǎn)移性 CRC SW620 細(xì)胞的外泌體通過(guò) Transwell 測(cè)定顯著促進(jìn)了 SW480 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖 2C）。此外，與 SW480-exo 和對(duì)照組相比，SW620-exo 提高了 SW480 細(xì)胞的傷口愈合能力（圖 2D）。蛋白質(zhì)印跡分析以確定與 EMT 相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果表明，相對(duì)于 SW480-exo 處理，SW620-exo 處理顯著增加波形蛋白、纖連蛋白和 N-鈣粘蛋白的表達(dá)并降低 E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖 2E），表明源自轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的外泌體在 SW480 中誘導(dǎo)了 EMT。

圖2來(lái)自轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞系 SW620 的外泌體促進(jìn) CRC 細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)

3. miR-335-5p 在來(lái)源于轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞的外泌體中高表達(dá)

作者進(jìn)行 miRNA 測(cè)序以確定 SW480-exo 或 SW620-exo 中的 miRNA 表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SW480-exo 和 SW620-exo 具有顯著不同的 miRNA 表達(dá)譜（圖 3A），并確定了 77 個(gè) miRNA 的倍數(shù)變化大于 5（圖 3B）。通過(guò)定量 PCR，證實(shí) miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表達(dá)比在 SW480-exo 中更高（圖 3C）。并使用來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的 miRNA 和 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，證實(shí)了 CRC 中的 miR-335-5p 相對(duì)于正常樣本顯著升高（圖 3D），以及 miR-335-5p 高表達(dá)的病例的總體存活率較低（圖 3E）。為了探索 miR-335-5p 在 CRC 中的功能，作者對(duì) miR-335-5p 高或低表達(dá)的 CRC 樣本中表達(dá)的基因進(jìn)行了基因集富集分析 (GSEA) 分析。確定了兩種生物學(xué)途徑的顯著富集：Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和 Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)（圖 3F 和 3G）。這些結(jié)果表明SW620外泌體具有較高水平的miR-335-5p，miR-335-5p在CRC中的功能可能與Ras信號(hào)通路的激活有關(guān)。

圖 3 miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表達(dá)顯著高于 SW80-exo

4. miR-335-5p通過(guò)靶向RASA1促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲

作者使用TargetScan、miRDB 和 miRTarBase miR-335-5p 三種生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)潛在的靶基因（圖 4A）。從 TCGA 下載的數(shù)據(jù)分析表明，RASA1 的表達(dá)與 CRC 患者的 miR-335-5p 水平顯著相關(guān)（圖 4B）。圖 4C 顯示了通過(guò)生物信息學(xué)分析確定的 RASA1 3' UTR 中的假定的miR-335-5p 靶位點(diǎn)。 使用野生型 (WT) RASA1 3' UTR 在 SW480 細(xì)胞中進(jìn)行的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染 miR-335-5p 模擬物后熒光素酶活性顯著降低（圖 4C）。 相比之下，突變 (mut) RASA1 序列的報(bào)告基因的熒光素酶活性不受 miR-335-5p 的影響（圖 4C），表明 miR-335-5p 直接靶向 RASA1 3' UTR 的特定區(qū)域。為了確定 miR-335-5p 對(duì) RASA1 的影響，使用 Lipofectamine 3000 將 miR-335-5p 模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到 SW480 和 SW620 細(xì)胞中。用定量逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR (qRT-PCR) 和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行評(píng)估表明 mRNA RASA1 和蛋白質(zhì)水平在模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖 4D）。 此外，miR-335-5p 轉(zhuǎn)染增加了 Ras 蛋白的表達(dá)（圖 4E）。 miR-335-5p 的上調(diào)可能伴隨著 EMT 激活，如 SW480 和 SW620 細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)增加和 E-鈣粘蛋白表達(dá)降低所證明的（圖 4F）。 此外，miR-335-5p 水平升高顯著促進(jìn)遷移和侵襲，而用 miR-335-5p 抑制劑抑制 miR-335-5p 顯著抑制 CRC 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖 4G 和 4H）。

圖 4 miR-335-5p 通過(guò)靶向 RASA1 抑制 CRC 細(xì)胞遷移、侵襲和 EMT

5. 外泌體傳遞的miRNA-335-5p通過(guò)靶向RASA1促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移、侵襲、EMT和轉(zhuǎn)移

作者用 miR-335-5p 模擬物或陰性對(duì)照 (NC) 轉(zhuǎn)染的 SW480 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中收集外泌體。使用 qRT-PCR 檢測(cè)這些外泌體中 miR-335-5p 的水平。結(jié)果顯示含有模擬物（miR-335-5p 模擬物-exo）的外泌體顯著促進(jìn)了 SW480 和 SW620 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖 5A 和 5B），并且還降低了 RASA1 蛋白表達(dá)并增加了 Ras 蛋白表達(dá)（圖 5C）。此外，miR-335-5p 模擬物-exo抑制 EMT，如上皮標(biāo)志物 E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低和間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白的表達(dá)增加（圖 5D）。最后，用 miR-335-5p 模擬物-exo處理的細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的體內(nèi)轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用（圖 5E 和 5F），肺表面宏觀結(jié)節(jié)的數(shù)量急劇增加。這些結(jié)果表明，外泌體介導(dǎo)的 miR-335-5p 穿梭可能會(huì)加速 CRC 細(xì)胞的體外遷移和侵襲以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)伴隨著 Ras 信號(hào)和 EMT 的激活。

圖5 外泌體傳遞 miRNA-335-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT，并降低RASA1水平

6. RASA1的上調(diào)消除了外泌體miR-335-5p對(duì)CRC細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用

為了進(jìn)一步確定 RASA1 在 CRC 細(xì)胞中的潛在功能，使用慢病毒載體建立了過(guò)表達(dá) RASA1 的穩(wěn)定 SW480 細(xì)胞系。 如圖 6A 和 6B 所示，在用表達(dá) RASA1 的慢病毒載體（lenti-RASA1；SW480-RASA1）轉(zhuǎn)染的 SW480 細(xì)胞中，實(shí)時(shí) PCR 和蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了 RASA1 mRNA 和蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)。 在過(guò)表達(dá) RASA1 的細(xì)胞中，Ras 和波形蛋白的蛋白質(zhì)水平顯著下調(diào)，而 E-鈣粘蛋白上調(diào)（圖 6C）。 此外，與 SW480 載體對(duì)照相比，SW480-RASA1 的遷移和侵襲能力顯著降低（圖 6D）。

接下來(lái)研究 RASA1 是否參與了 CRC 細(xì)胞中外泌體 miR-335-5p 對(duì)遷移、侵襲和 EMT 的誘導(dǎo)。 蛋白質(zhì)印跡分析顯示，miR-335-5p模擬物-exo增加了Ras和波形蛋白的蛋白水平，但降低了RASA1和E-鈣粘蛋白的蛋白水平； 對(duì)于 RASA1 過(guò)表達(dá)，觀察到這些蛋白質(zhì)的反向表達(dá)趨勢(shì)（圖 6E）。 此外，RASA1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了 miR-335-5p模擬物-exo誘導(dǎo)的 SW480 細(xì)胞遷移和侵襲（圖 6F）。 這些結(jié)果表明外泌體 miR-335-5p 可能通過(guò)靶向 RASA1 誘導(dǎo)遷移、侵襲和 EMT。

圖6 RASA1異位表達(dá)抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲，消除外泌體miR-335-5p對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用

結(jié)論：

該研究揭示了外泌體 miR-335-5p 在 CRC 轉(zhuǎn)移中的新功能，并闡明了外泌體包裹的 miR-335-5p 通過(guò)直接靶向 RASA1 促進(jìn) CRC 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和 EMT 轉(zhuǎn)化。 這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明外泌體 miR-335-5p 可能是一種預(yù)后生物標(biāo)志物，并為解決 CRC 轉(zhuǎn)移提供有價(jià)值的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Sun X, Lin F, Sun W, Zhu W, Fang D, Luo L, Li S, Zhang W, Jiang L. Exosome-transmitted miRNA-335-5p promotes colorectal cancer invasion and metastasis by facilitating EMT via targeting RASA1. Mol Ther Nucleic Acids. 2021; 24:164-174. doi: 10.1016/j.omtn.2021.02.022