膽固醇穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致鐵死亡抵抗增加腫瘤的致瘤性和轉(zhuǎn)移

高膽固醇血癥和血脂異常與許多癌癥類型的風(fēng)險(xiǎn)增加和已確診疾病患者的不良預(yù)后相關(guān)。然而，這種情況發(fā)生的機(jī)制是多因素的。證據(jù)表明，高膽固醇血癥是絕經(jīng)后婦女患乳腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。作者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞長期暴露于27-羥基膽固醇(27HC)，一種豐富的循環(huán)膽固醇代謝物，會(huì)選擇性使細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞攝取和/或脂質(zhì)生物合成增加。這些細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的能力。重要的是，積累的脂質(zhì)對(duì)細(xì)胞施加的代謝壓力需要GPX4的持續(xù)表達(dá)，這是一種鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)劑。作者發(fā)現(xiàn)鐵死亡抵抗是轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的一個(gè)特征，并進(jìn)一步證實(shí)GPX4敲除減輕了27HC抵抗細(xì)胞的腫瘤生成和轉(zhuǎn)移活性。本文于2021年9月發(fā)表在《Nature Communications》IF:14.919。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、羥甾醇27HC通過抑制膽固醇攝取/合成的能力來減少癌細(xì)胞的生長

首先評(píng)估了27HC對(duì)雌激素受體（ER）陽性MCF7細(xì)胞在去除外源性類固醇的培養(yǎng)基(炭剝離培養(yǎng)基(CFS))與完全培養(yǎng)基（FBS）中的生長活性。在這里，使用的27HC的濃度范圍是正常個(gè)體循環(huán)中的~1 μM至高脂血癥患者體內(nèi)的2.5–5 μM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CFS中，雌激素活性的27HC支持了細(xì)胞增殖，但是在FBS中，同樣濃度的27HC抑制了細(xì)胞增殖（Fig 1a）。類似的，27HC在CFS中促進(jìn)集落形成，在FBS中抑制集落形成（Fig 1b）。但是這些結(jié)果在ER陰性細(xì)胞完全相反，其27HC抑制了乳腺癌細(xì)胞系4T1, MDAMB436, Py230, MDAMB231, HCC1954的增殖（Fig 1c）。在2D培養(yǎng)體系中，雌激素?zé)o反應(yīng)的Met1細(xì)胞對(duì)27HC的抗增殖活性具有抵抗作用，但是在3D培養(yǎng)的集落形成實(shí)驗(yàn)中，27HC有效的抑制了4T1，Met1的集落形成（Fig. 1d）。這些結(jié)果表明，不同于ER陽性細(xì)胞，在ER陰性細(xì)胞中27HC抑制細(xì)胞增殖，集落形成和體外遷移。

我們認(rèn)為27HC對(duì)觀察到的ER陰性癌細(xì)胞生物學(xué)的影響可能歸因于它作為膽固醇合成/攝取的負(fù)調(diào)控因子通過對(duì)SREBP和LXR依賴的信號(hào)通路的作用。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)在受檢的腫瘤細(xì)胞中，27HC抑制SREBP1c和SREBP2的靶基因的表達(dá)，而作為LXR受體激動(dòng)劑活性也在一些細(xì)胞系中觀察到（Fig. 1e）。盡管如此，作者不認(rèn)為27HC的LXR活性對(duì)其癌細(xì)胞的作用有顯著貢獻(xiàn)，因?yàn)橐呀?jīng)證明(a)在探索的細(xì)胞中，27HC是LXR相對(duì)較弱的部分激動(dòng)劑，(b) LXR完全激動(dòng)劑在這些細(xì)胞中不復(fù)制27HC的抗增殖活性。因此，盡管27HC可以激活LXR并誘導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流相關(guān)基因的表達(dá)，但這種活性不足以抑制癌細(xì)胞的增殖。這就表明27HC的主要功能可能是抑制SREBP依賴的脂質(zhì)/膽固醇攝取和合成。為了支持這一觀點(diǎn)，作者證明了補(bǔ)充膽固醇可以逆轉(zhuǎn)27HC的抗增殖活性（Fig. 1d），而甲戊酸和其他膽固醇生物合成的上游中間體無法挽救27HC對(duì)癌細(xì)胞生長或集落形成的抑制作用（Fig. 1d）。以上表明27HC在細(xì)胞中的抗增殖活性主要是抑制膽固醇的合成/攝取。

圖1 27HC抑制ER陰性乳腺癌細(xì)胞的生長

2、在體內(nèi)，慢性暴露于27HC可選擇更具致瘤性和轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞

目前已建立的聯(lián)系是膽固醇升高和癌癥進(jìn)展相關(guān)，作者認(rèn)為，雖然這些臨床觀察與27HC抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果不一致，這可能與本研究中通過使細(xì)胞/腫瘤發(fā)生膽固醇/ 27HC急性升高而建立的高膽固醇血癥模型有關(guān)。為了探索這種可能性，構(gòu)建27HC抗性版本的4T1、Py230、BPD6、HCC1954、MDAMB436和B16F10細(xì)胞，在5μM 27HC持續(xù)存在的2D培養(yǎng)中傳代14個(gè)月，直到菌落出現(xiàn)。4T1、Py230和BPD6的27HC敏感和等基因抗性細(xì)胞在2D培養(yǎng)下的時(shí)間/劑量-響應(yīng)生長曲線如Fig. 2a所示。盡管27HC的敏感性存在顯著差異，但在不含27HC的情況下，敏感細(xì)胞（27HCS）和耐藥細(xì)胞（27HCR）的總體增殖能力相似。然而，當(dāng)作為異種移植物在小鼠體內(nèi)傳播時(shí)，所有這三種細(xì)胞模型的27HC抵抗衍生物都顯示出比27HC敏感的衍生物更具有致瘤性(Fig.2b)。尾靜脈注射模型評(píng)估敏感和耐藥細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示，在三種模型(4T1, Py230和BPD6)中，對(duì)27HC的抗性與顯著增加的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)(圖2c)。綜上所述，細(xì)胞在適應(yīng)27HC水平的增加時(shí)，獲得了使它們更具致瘤性和轉(zhuǎn)移性的活性。

圖2慢性暴露于27HC可選擇性增加惡性表型的細(xì)胞

3、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累增加是抗27HC的一個(gè)特征，也和致瘤性有因果關(guān)系

隨后探究27HC抵抗增加致瘤性和轉(zhuǎn)移性的生物化學(xué)機(jī)制。首先探討了27HC下調(diào)膽固醇/脂類合成的機(jī)制可能在抵抗細(xì)胞中被破壞的可能性。然而，基因表達(dá)分析顯示，在基礎(chǔ)條件下，編碼這些過程的關(guān)鍵調(diào)控步驟的mRNA變化不大，而且在敏感和耐藥細(xì)胞中，27HC仍然是它們表達(dá)的有效抑制劑（Fig. 3a）。這表明在27HC抵抗細(xì)胞中，27HC對(duì)SREBP活性的負(fù)反饋保持完整。然而，使用BODIPY染色評(píng)估脂質(zhì)含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有27HCR細(xì)胞都積累了大量的中性脂質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)脂滴(LDs)的形式儲(chǔ)存（Fig. 3b）。提示為了抵消27HC對(duì)膽固醇和脂類合成的抑制作用，27HCR細(xì)胞可能增加了它們攝取中性脂質(zhì)的能力。為了直接解決這一問題，并確認(rèn)積累的脂質(zhì)的身份，對(duì)HCC1954細(xì)胞的27HCR和27HCS衍生物進(jìn)行了全面的脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)27HC抗增殖作用的一個(gè)特點(diǎn)是脂質(zhì)攝取增加和脂質(zhì)生物合成的減少。

雖然脂質(zhì)攝取增加和/或生物合成之間的關(guān)聯(lián)被確定為27HC耐藥的標(biāo)志，但這種活性在多大程度上與耐藥相關(guān)和/或是否有助于癌細(xì)胞生物學(xué)的變化尚不清楚。為了解決這一問題，作者反復(fù)研究了27HCS和27HCR的4T1、Py230、HCC1954、B16F10和BPD6細(xì)胞在富脂和脫脂培養(yǎng)基中對(duì)27HC的敏感性/耐藥性。如Fig. 3c所示，除BPD6細(xì)胞外，27HC的抗增殖活性僅在脂質(zhì)充足的條件下表現(xiàn)出來。鑒于與BPD6-27HCS相比，BPD6-27HCR中涉及膽固醇和脂肪酸生物合成的基因表達(dá)上調(diào)(見Fig.S4a和Fig.S2)，這些細(xì)胞中積累的一些脂質(zhì)可能是內(nèi)源性產(chǎn)生的。研究還強(qiáng)調(diào)了脂質(zhì)積累在耐藥細(xì)胞中的重要性，研究表明脂質(zhì)消耗逆轉(zhuǎn)了27HCR細(xì)胞體外遷移能力的增加（Fig. 3d）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在獲得對(duì)27HC的抗性時(shí)，27HCR細(xì)胞增加了它們的脂質(zhì)攝取，這一活動(dòng)可能有助于增加它們的惡性表型。

圖3脂質(zhì)攝取增加是細(xì)胞抵抗27HC抗增殖作用的一個(gè)特征

4、27HC抗性細(xì)胞可防止細(xì)胞鐵死亡

異常的脂質(zhì)代謝涉及到癌癥細(xì)胞病理學(xué)的多個(gè)方面。但是本研究中觀察到的27HC細(xì)胞中脂質(zhì)積累也被認(rèn)為是給細(xì)胞帶來了代謝壓力，而27HC細(xì)胞克服了這種脂質(zhì)過氧化的積累。近來，細(xì)胞可以忍受GPX4依賴抗氧化途徑和脂質(zhì)氧化酶下調(diào)產(chǎn)生的脂質(zhì)依賴壓力。因此，作者推測在進(jìn)化到27HC耐藥狀態(tài)的過程中，癌細(xì)胞可能會(huì)增加誘導(dǎo)鐵死亡的閾值。作為這些研究的起點(diǎn)，作者評(píng)估了GPX4在幾種細(xì)胞系(B16F10、Py230、HCC1954和MDAMB436)中的表達(dá)。WB表明，GPX4在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，且在27HC濃度增加的情況下，GPX4表達(dá)下調(diào)（Fig. 4a）。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，盡管并非完全出乎意料，因?yàn)?/span>GPX4合成所需的特殊selenocysteine-tRNA的成熟需要焦磷酸異戊酯（來自甲戊酸途徑）。事實(shí)上，在細(xì)胞補(bǔ)充外源性甲戊酸后，27HC依賴性下調(diào)GPX4的表達(dá)會(huì)顯著減弱（Fig. 4b）。此外，在Py230、HCC1954和MDAMB436細(xì)胞的27HCR衍生物中，觀察到與脂質(zhì)過氧化增加相關(guān)的基因(Acsl4、Lpcat3和Pebp1)的表達(dá)下調(diào)（Fig. 4c）。綜上，調(diào)控機(jī)制的破壞導(dǎo)致GPX4的下調(diào)，以及通過調(diào)節(jié)與脂質(zhì)過氧化相關(guān)基因的表達(dá)來降低GPX4通路的脅迫，是27HCR細(xì)胞的一個(gè)特征。無論其機(jī)制如何，作者推斷，如果GPX4的穩(wěn)定表達(dá)和/或活性與27HC抗性表型(ferroptosis)有因果關(guān)系，那么27HCR細(xì)胞應(yīng)該對(duì)GPX4途徑的抑制劑有更強(qiáng)的抗性。如Fig.4d所示，B16F10、Py230、MDAMB436、HCC1954和4T1細(xì)胞對(duì)GPX4的直接抑制劑(RSL3和ML210)和xc轉(zhuǎn)運(yùn)體(erastin)的抗性明顯增強(qiáng)。這些藥物對(duì)所有27HCS細(xì)胞活力的影響被ferroptosis抑制劑ferrostatin逆轉(zhuǎn)，證實(shí)鐵死亡確實(shí)是這些藥物靶向的目標(biāo)。進(jìn)一步研究表明GPX4抑制劑(RSL3和ML210)導(dǎo)致27HCS細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物大量增加，但在27HCR細(xì)胞系中沒有觀察到(圖4e)。結(jié)論是，在適應(yīng)脂質(zhì)誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激中，細(xì)胞可以通過穩(wěn)定GPX4的表達(dá)，增加GPX4依賴的抗氧化系統(tǒng)的活性，或減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生來避免鐵死亡，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)27HC的抗性。

圖4 27HCR細(xì)胞對(duì)鐵死亡有抗性

5、GPX4活性預(yù)防鐵死亡促進(jìn)轉(zhuǎn)移

作者推測細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抗性可能使細(xì)胞能夠抗住在轉(zhuǎn)移過程中面臨的代謝和環(huán)境壓力。如Fig. 5a所示，注射Py230-27HCS細(xì)胞的小鼠發(fā)生micrometastasis，而注射Py230-27HCR細(xì)胞的小鼠發(fā)生macrometastasis；但是無論是從micrometastasis還是從macrometastasis處分離出的轉(zhuǎn)移病灶表現(xiàn)出相似的對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑（RSL3和ML210）相同的抗性（Fig. 5a，右）。因此，27HCR細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的增加可能是促進(jìn)27HC抗性的適應(yīng)性事件的結(jié)果，而不是與羥甾醇治療相關(guān)的基因表達(dá)/生化活性的特定變化。

此外，GPX4的敲除顯著降低了B16F10細(xì)胞27HCS和27HCR衍生物的轉(zhuǎn)移，盡管后者的轉(zhuǎn)移程度較低（Fig. 5b）。同樣，通過直接計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)證明，在Py230細(xì)胞的27HCR衍生物中觀察到的轉(zhuǎn)移表型在GPX4敲低后完全消除（Fig. 5c）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了GPX4在轉(zhuǎn)移過程中預(yù)防鐵死亡的重要作用。

圖5 GPX4抑制可使27HCR細(xì)胞對(duì)ferroptosis敏感并降低其轉(zhuǎn)移能力

總之，在處理與脂質(zhì)代謝失調(diào)相關(guān)的壓力時(shí)，細(xì)胞如何上調(diào)GPX4軸的活性和/或減少對(duì)GPX4的依賴以適應(yīng)這種壓力，這有增加細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的附帶責(zé)任。急性27HC （Fig.5，左）處理通過干擾SREBPs和LXR信號(hào)傳導(dǎo)擾亂脂質(zhì)代謝，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長和遷移的抑制。癌細(xì)胞可以適應(yīng)由慢性27HC處理帶來的代謝壓力（Fig.5，右）。存活的細(xì)胞(27HC抵抗細(xì)胞)增加脂質(zhì)攝取，并通過上調(diào)抵抗脂質(zhì)氧化應(yīng)激過程的活性來調(diào)節(jié)與此活動(dòng)相關(guān)的代謝應(yīng)激，一種增強(qiáng)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移能力的活動(dòng)。

圖6 腫瘤細(xì)胞對(duì)27HC治療的反應(yīng)的機(jī)制模型

參考文獻(xiàn)：

Liu Wen., Chakraborty Binita., Safi Rachid., Kazmin Dmitri., Chang Ching-Yi., McDonnell Donald P.(2021). Dysregulated cholesterol homeostasis results in resistance to ferroptosis increasing tumorigenicity and metastasis in cancer. Nat Commun, 12(1), 5103. doi:10.1038/s41467-021-25354-4