來自腎小管細胞的外泌體miR-21促進腎纖維化

輸尿管梗阻引起的腎積水與腎纖維化和進行性慢性腎病(CKD)有關(guān)。外泌體介導(dǎo)的細胞-細胞通訊被認為與各種疾病有關(guān)，包括腎纖維化。然而，對于外泌體如何調(diào)節(jié)梗阻腎臟的腎纖維化知之甚少。2021年8月發(fā)表于Theranostics（IF=11.556）的文章“Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys“對此進行了介紹。研究發(fā)現(xiàn)腎纖維化的增加與單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)的延長天數(shù)有關(guān)，外泌體分泌在UUO腎和TGF-β1刺激的NRK-52E細胞中顯著增加。從TGF-β1刺激的NRK-52E細胞中純化的外泌體可激活成纖維細胞并加重腎纖維化。此外，Rab27a敲除或GW4869處理抑制外泌體分泌可消除成纖維細胞激活，改善腎纖維化。TGFβ1-Exos中外泌體miR-21較Ctrl-Exos明顯升高，且PTEN是miR-21的靶點。在體外，上皮外泌體miR-21的促進或抑制相應(yīng)地加速或消除成纖維細胞的激活，而在體內(nèi)，miR-21缺陷的外泌體通過PTEN/Akt途徑緩解UUO后腎纖維化。我們的研究結(jié)果表明，來自腎小管上皮細胞的外泌體miR-21可能通過miR-21/PTEN/Akt通路激活成纖維細胞，從而加速腎纖維化的發(fā)展。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）UUO誘導(dǎo)的腎纖維化模型中TGF-β1的表達和外泌體的產(chǎn)生增加

我們首先通過Masson三色染色、Sirius紅染色、western blotting和免疫組化方法評估UUO-3d和UUO-7d模型腎纖維化和TGF-β1的表達(圖1A-H)。結(jié)果提示，TGF-β1表達和腎纖維化與梗阻天數(shù)呈正相關(guān)。為了進一步闡明外泌體是否在UUO模型中發(fā)揮作用，我們進行了透射電鏡、免疫熒光和western blotting檢測。透射電鏡顯示UUO后細胞外囊泡分泌明顯增加。此外，許多細胞外囊泡的外泌體直徑為30-150 nm(圖1I)。CD63和TSG101(外泌體標(biāo)記物)的Western blot(圖1G和H)和免疫染色(圖1J-L)顯示，外泌體在UUO-3d組中明顯增加，在UUO-7d組中進一步增加。此外，外泌體主要分布在腎小管上皮周圍(圖1J)。

2）TGF-β1促進腎小管上皮細胞分泌外泌體，并在體外激活成纖維細胞

我們研究了腎小管來源的外泌體在介導(dǎo)成纖維細胞激活中的潛在作用。TGF-β1作為主要的成纖維因子，用于刺激UUO腎損傷/應(yīng)激小管細胞的狀態(tài)。不同濃度TGF-β1伴或不伴GW4869孵育24小時后，NRK-52E細胞與無外泌體培養(yǎng)基孵育24小時，從條件培養(yǎng)基中收集外泌體來刺激正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞(NRK-49F細胞)(圖2A)。如圖2B-D所示，NTA、DLS和TEM顯示大部分分離的細胞外囊泡為外泌體。CD63的Western blot分析證實，外泌體的分泌依賴于TGF-β1的濃度，而GW4869處理明顯抑制了細胞外基質(zhì)的沉積(圖2E-F)。隨后我們用PKH-67標(biāo)記NRK-52E細胞，熒光強度顯著增強，進一步證實TGF-β1處理后外泌體分泌增加(圖2G)。此外，PKH-67標(biāo)記的外泌體與NRK-49F細胞孵育后被成纖維細胞吸收(圖2H)。從TGF-β1處理的NRK-52E細胞中分離的外泌體能夠誘導(dǎo)NRK-49F細胞增殖和基質(zhì)生成，表現(xiàn)為α-SMA、PCNA、Col-I和纖連蛋白表達增加。而GW4869處理明顯逆轉(zhuǎn)了上述變化(圖2I-N)。

3）腎小管細胞來源的外泌體促進體內(nèi)腎纖維化

為了研究腎小管來源的外泌體與UUO誘導(dǎo)的纖維化在體內(nèi)的相關(guān)性，我們使用UUO模型進行了動物研究，注射從TGF-β1處理的NRK-52E細胞中分離出來的TGFβ1-exos。實驗設(shè)計如圖3A所示。如圖3B所示，在體內(nèi)，我們觀察到NRK-52E細胞PKH-67標(biāo)記的TGFβ1-Exos存在于梗阻的腎臟中。此外，與Ctrl-Exo相比，注射TGFβ1-Exo可以明顯誘導(dǎo)CD63和TSG101的表達(圖3C-D)。然后我們檢測了外泌體注射對UUO腎臟的影響。如圖3E-L所示，與Ctrl-Exos相比，TGFβ1-Exos促進了UUO后7天阻塞腎臟中成纖維細胞的增殖，并加劇了纖維連接蛋白和膠原沉積。

4）Rab27a敲除可抑制外泌體分泌，減輕UUO誘導(dǎo)的體內(nèi)腎纖維化

如圖4A-C所示，成功構(gòu)建并證實了Rab27a敲除小鼠(Rab27a-/-)。western blot檢測CD63的表達，表明敲除Rab27a可減少UUO腎臟的外泌體分泌(圖4D-E)。接下來我們檢查了成纖維細胞的激活和纖維連接蛋白和膠原的沉積。western blotting(圖4F, I)和免疫熒光(圖4F, H, J)檢測證實了敲除Rab27a明顯抑制了成纖維細胞的激活。同時，Masson染色，Col-I免疫組化染色和纖維連接蛋白免疫熒光染色證實，敲除Rab27a可通過抑制膠原蛋白和纖維連接蛋白沉積而改善UUO后腎纖維化(圖4G, K-M)。

5）腎小管細胞來源的外泌體miR-21促進體外成纖維細胞活化

為了探究管狀細胞來源的外泌體miRNA是否發(fā)揮作用，我們進行了miRNA測序(圖5A)。在所有改變的miRNA中，miR-21的升高最為顯著，我們進一步證實，TGF-β1處理后，miR-21在NRK-52E細胞和NRK-52E傳遞的外泌體中被誘導(dǎo)(圖5D)。為了證實外泌體miR-21的作用，我們將miR-21模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染到NRK-52E細胞中，使其過表達或抑制外泌體miR-21(圖5B)，并通過PCR驗證轉(zhuǎn)染效果(圖5E)。細胞轉(zhuǎn)染和TGF-β1處理后，立即在NRK-49F細胞中加入相應(yīng)的外泌體。如圖5C和5F-I所示，miR-21模擬轉(zhuǎn)染的NRK-52E細胞的外泌體刺激NRK-49F細胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達及細胞增殖明顯增加。同樣，當(dāng)miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染的NRK-52E細胞的外泌體刺激NRK-49F細胞時，Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達以及細胞增殖均明顯下降。

6）PTEN是miR-21的一個潛在靶點

我們進一步研究了腎小管細胞來源的外泌體miR-21介導(dǎo)成纖維細胞激活的可能機制。TargetScan軟件預(yù)測PTEN基因的3 '-UTR是miR-21的保守結(jié)合位點(圖6A)。為了驗證miR-21與PTEN的關(guān)系，我們構(gòu)建了攜帶PTEN 3’UTR的野生型PTEN (PTEN-WT)熒光素酶報告基因。將帶有PTEN-WT的miR-21模擬物轉(zhuǎn)染到NRK-49F細胞后，與Ctrl組相比，miR-21模擬物抑制了PTEN-miR-21轉(zhuǎn)染細胞中的熒光素酶活性(圖6B)。最后，我們通過western blot檢測NRK-49F細胞中PTEN和下游p-Akt的表達水平。當(dāng)使用miR-21模擬轉(zhuǎn)染的NRK-52E細胞的外泌體刺激時，PTEN明顯降低，p-Akt升高，但當(dāng)使用miR-21抑制物轉(zhuǎn)染的NRK-52E細胞的外泌體刺激時，這些變化被緩解(圖6C-E)。

7）腎小管細胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路介導(dǎo)體外成纖維細胞激活

為了進一步證實miR-21在PTEN中的作用，NRK-49F細胞在接受NRK-52E遞送的外泌體之前，先用PTEN siRNA處理(圖7A)，與si-NC組相比，PTEN mRNA明顯受到抑制(圖7B)。CCK-8(圖7C)和PTEN的western blot表達(圖7H, K)表明，不經(jīng)外泌體干預(yù)的siPTEN轉(zhuǎn)染顯著促進了NRK-49F的增殖。在外泌體干預(yù)組中，單獨轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可抑制NRK-49F增殖，同時轉(zhuǎn)染siPTEN后明顯逆轉(zhuǎn)。免疫熒光染色顯示，轉(zhuǎn)染siPTEN后，NRK-49F細胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA表達明顯增加。在外泌體干預(yù)組中，單獨轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可抑制上述指標(biāo)，同時轉(zhuǎn)染siPTEN后則明顯逆轉(zhuǎn)。western blot檢測通路相關(guān)蛋白PTEN和p-Akt，如圖7H-J所示。未經(jīng)外泌體干預(yù)的siPTEN轉(zhuǎn)染可顯著抑制PTEN，但加速p-Akt。在外泌體干預(yù)組中，單獨轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可加速PTEN并抑制p-Akt，但與siPTEN共轉(zhuǎn)染后這種作用被逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明，腎小管細胞來源的外泌體miR-21可以通過PTEN/Akt途徑介導(dǎo)成纖維細胞的激活。

8）腎小管細胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路促進體內(nèi)腎纖維化

為驗證外泌體miR-21在體內(nèi)的作用機制，采用TGFβ1-Exo注射UUO模型進行動物實驗。NRK-52E細胞的TGFβ1-Exos在UUO后7天增加了細胞外基質(zhì)和成纖維細胞增殖。同時抑制腎小管細胞來源的外泌體中miR-21的表達可抑制成纖維細胞的激活和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生(圖8A-D, 8E-G)。我們進一步發(fā)現(xiàn)腎小管細胞來源的外泌體在UUO后下調(diào)PTEN并激活p-Akt。此外，外泌體中抑制miR-21可上調(diào)PTEN并抑制p-Akt(圖7F, H-I)。

  結(jié)論：我們證明了腎小管細胞來源的外泌體在輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎積水和長期腎纖維化中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)UUO后含有miR-21的外泌體的產(chǎn)生增加。管狀細胞來源的外泌體miR-21通過靶向PTEN促進成纖維細胞激活，并影響PTEN/Akt通路。這些結(jié)果引入了一種新的機制，解釋了UUO模型中細胞-細胞通信是如何由外泌體介導(dǎo)的，并表明外泌體可能是一個新的開發(fā)領(lǐng)域，以延緩或減緩腎纖維化的進展。

參考文獻：Zhao S, Li W, Yu W, Rao T, Li H, Ruan Y, Yuan R, Li C, Ning J, Li S, Chen W, Cheng F, Zhou X. Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys. Theranostics. 2021 Aug 2;11(18):8660-8673. doi: 10.7150/thno.62820.