長鏈非編碼RNA NR2F1-AS1通過調(diào)控NR2F1和ΔNp63 誘導(dǎo)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移性休眠

彌散性腫瘤細胞通常在遠處器官中進入長期的休眠期，其特征是增殖減少但持續(xù)存活，直到轉(zhuǎn)移生長覺醒。然而，轉(zhuǎn)移性休眠和覺醒的調(diào)節(jié)機制在乳腺癌中仍然是未知的。本文中，作者發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細胞樣細胞（BSCS）的上皮樣細胞和間充質(zhì)樣細胞在肺中表現(xiàn)出不同程度的休眠和致瘤性,于是進一步探索調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移性休眠的機制。本文于2021年10月發(fā)表在《 Nature Communications》雜志上，IF=12.121。

本文技術(shù)路線：

主要結(jié)果如下：

1.BSCS的間充質(zhì)細胞亞群在肺部常發(fā)生轉(zhuǎn)移休眠

許多研究報道了乳腺癌干細胞樣細胞（BCSCs）的異質(zhì)性。早期在MCF10乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了兩個BCSC亞群，其中的CD24?CD44med亞群(后面稱為P1)，CD44染色較弱，但檢測為陽性。另一個CD24?CD44 high亞群(后面稱為P2)，CD44染色更強。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，與沒有CSC的細胞相比，P1和P2能顯著提高致瘤能力，但只有P1能誘導(dǎo)BCSC轉(zhuǎn)移。P1和富含P1細胞的轉(zhuǎn)移細胞系MCF10CA1a中有上皮標記物CDH1的表達；而P2為間充質(zhì)樣亞群，能增強了體外遷移和侵襲特性。在含血清培養(yǎng)基中傳代多次后，P1細胞部分轉(zhuǎn)化為P2細胞，而在無血清培養(yǎng)基中則沒有出現(xiàn)這種情況。當細胞被注射到小鼠體內(nèi)時，P2腫瘤往往顯示出更強的侵襲能力（Fig.1a）。

由于間充質(zhì)樣P2細胞表現(xiàn)出更高的遷移、侵襲和播散能力，但與上皮樣P1細胞相比，肺轉(zhuǎn)移數(shù)目卻較少，作者試圖分析這些細胞的轉(zhuǎn)移過程。

富含P1細胞的轉(zhuǎn)移細胞系MCF10CA1a，轉(zhuǎn)移性較低的細胞系MCF10CA1h，以及P1和P2亞群(CA1h-P1和CA1h-P2)通過螢火蟲熒光素酶和GFP標記，再接種到小鼠中分析其在肺部的轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MCF10CA1a細胞系相比，MCF10CA1h細胞系出現(xiàn)更多的GFP標記，與CA1h-P1細胞相比，CA1h-P2細胞GFP標記更顯著(Fig. 1b, c)。然而，MCF10CA1h和CA1h-P2細胞在定殖初期不同時間點均有增殖活性(Fig. 1b, c)。小鼠生物熒光成像(BLI)的長期轉(zhuǎn)移監(jiān)測也顯示初始播種期后肺內(nèi)CA1h-P1穩(wěn)定生長，而CA1h-P2細胞信號在18周后基本保持不變，但初始強度有所增強(Fig. 1d)。很多老鼠接種MCF10CA1a和CA1h-P1細胞最終在肺部發(fā)生轉(zhuǎn)移(Fig. 1e)，肺表面可見明顯的腫瘤結(jié)節(jié)(Fig. 1f)和侵襲性腫瘤區(qū)域(Fig. 1g)。在20周內(nèi)，MCF10CA1h和CA1h-P2保持為單細胞或小灶(Fig. 1g, h)，導(dǎo)致腫瘤結(jié)節(jié)減少(Fig. 1f)。這些結(jié)果表明MCF10CA1h和CA1h-P2在肺部顯示出休眠表型。

Fig1 P2 BCSC亞群在肺中顯示休眠表型

2.NR2F1-AS1在潛伏細胞中高表達，并促進轉(zhuǎn)移性休眠

然后，作者將肺休眠細胞(MCF10CA1h和CA1h-P2)和肺轉(zhuǎn)移細胞(MCF10CA1a和CA1h-P1)以及在小鼠不能擴散到肺的MCF10AT進行測序比較。重點關(guān)注參與轉(zhuǎn)移性休眠的LncRNA，在肺休眠細胞中發(fā)現(xiàn)了18個上調(diào)和7個下調(diào)的LncRNA (Fig. 2a)。NAS1表達與腫瘤復(fù)發(fā)潛伏期相關(guān)，NR2F1-AS1(NAS1)位于蛋白編碼基因NR2F1的上游，但轉(zhuǎn)錄方向相反，屬于上調(diào)的LncRNA。NAS1的片段長度在顯示為3000bp左右(Fig. 2b)。進一步進行GSEA分析，顯示NAS1敲低導(dǎo)致CA1h-P2轉(zhuǎn)錄組向P1樣態(tài)轉(zhuǎn)變，在NAS1 敲除后雖然肺部GFP+癌細胞更少，但這些細胞更具有增殖能力(Fig. 2c)，4個月后，肺部會發(fā)生轉(zhuǎn)移生長增強和甚至表現(xiàn)出更多的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(Fig. 2d, e)。相反，過表達NAS1雖然在MCF10AT和CA1h-P1中增強了初始癌細胞在肺部的數(shù)量，但削弱了其增殖能力(Fig. 2f)，導(dǎo)致肺部單個腫瘤細胞持續(xù)存在，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)減少(Fig. 2g,h)。將乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移亞系MDA-MB-231原位注射到小鼠的乳腺脂肪中。后續(xù)分析顯示NAS1增強腫瘤侵襲能力(Fig. 2i),但導(dǎo)致更多獨立的腫瘤細胞并造成更少的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)(Fig. 2 j, k)。這些數(shù)據(jù)表明，NAS1促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,但抑制轉(zhuǎn)移性產(chǎn)物的擴散,導(dǎo)致乳腺癌細胞在肺部的休眠。

Fig. 2 NR2F1-AS1 (NAS1)促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移性休眠

3.NAS1促進EMT和侵襲，但抑制癌細胞的腫瘤啟動能力

為了分析為什么NAS1會促進癌細胞生長，但抑制肺轉(zhuǎn)移，作者首先分析了癌細胞的EMT狀態(tài)和侵襲性。從細胞形態(tài)和各種EMT標記物的表達可以看出(Fig. 3a)，在CA1h-P2 CSC亞群中，NAS1敲低可部分誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(MET)。此外，作者還觀察到，在CA1h-P2細胞中，NAS1敲低導(dǎo)致CD44下調(diào)，而在MCF10AT細胞中ALDH上調(diào)，而過表達NAS1能促進ALDH+細胞向cd44間質(zhì)轉(zhuǎn)化CSCs((Fig. 3b–e)，證實了NAS1促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。 轉(zhuǎn)移性生長需要擴散的癌細胞產(chǎn)生新的腫瘤的能力。因此，作者接下來進一步評估NAS1在腫瘤啟動中的作用。NAS1敲低顯著增加CA1h-P2形成腫瘤的能力(Fig. 3f)。此外，腫瘤發(fā)生的限制性稀釋試驗顯示，NAS1敲低極大地增加了體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和CA1h-P2引起的的腫瘤生長(Fig. 3g, h)。相反，在MCF10AT中過表達NAS1將會阻遏腫瘤的形成(Fig. 3i)。此外，作者發(fā)現(xiàn)在MCF10CA1a中過表達NAS1會降低了小鼠細胞的致瘤能力(Fig. 3j),，并降低原發(fā)腫瘤切除后的腫瘤復(fù)發(fā)率(Fig.3k)?？偟膩碚f，NAS1促進了腫瘤擴散和擴散所必需的癌細胞特征，包括EMT、遷移和侵襲，但抑制了啟動新腫瘤生長的能力，從而導(dǎo)致了傳播后休眠。

Fig3. NAS1促進EMT但抑制乳腺癌細胞的致瘤性

4. NAS1通過上調(diào)NR2F1來促進休眠

接下來，作者探討了NAS1在轉(zhuǎn)移調(diào)控中的分子機制。重點關(guān)注了位于NAS1附近的NR2F1基因，該基因編碼一個促進腫瘤休眠的轉(zhuǎn)錄因子。作者發(fā)現(xiàn)NR2F1在不同轉(zhuǎn)移能力的MCF10細胞中存在差異表達，NAS1能上調(diào)NR2F1的表達(Fig. 4a) 。此外，NR2F1過表達表現(xiàn)出類似NAS1的作用，能誘導(dǎo)細胞增殖(Fig. 4b)，并在多個細胞系中抑制腫瘤球的形成(Fig. 4c)。為了進一步驗證NR2F1是否作用于NAS1下游調(diào)控轉(zhuǎn)移性休眠，將NR2F1在NAS1敲低的CA1h-P2細胞中過表達。NR2F1有效地恢復(fù)了這些細胞的間充質(zhì)樣表型(Fig. 4d)。此外，NR2F1降低了因NAS1敲低而增強的腫瘤形成能力(Fig. 4e, f)。更重要的是，當CA1h-P2細胞接種到小鼠體內(nèi)，NR2F1過表達消除了NAS1敲除的作用，抑制了腫瘤細胞增殖(圖4g)，減少了肺轉(zhuǎn)移瘤的生長和腫瘤結(jié)節(jié)的形成。這些數(shù)據(jù)提示，NAS1通過調(diào)節(jié)NR2F1促進乳腺癌轉(zhuǎn)移性休眠。

Fig4. NAS1通過NR2F1抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

5.NAS1和PTBP1共同增強NR2F1-5'UTR的IRES活性

為了進一步研究NAS1如何調(diào)控NR2F1的表達，作者對NAS1進行RNA下拉實驗，并進行質(zhì)譜分析。將PTBP1作為結(jié)合蛋白，通過 WB實驗發(fā)現(xiàn) PTBP1能拉下NAS1 (Fig. 5a)。RNA免疫沉淀法也檢測到PTBP1的免疫沉淀中含有NAS1， RNA(RIP)分析，進一步證明NAS1與PTBP1 的結(jié)合(Fig. 5b)。

接下來，作者分析了PTBP1在NR2F1表達中的作用。在MCF10AT中，過表達PTBP1可上調(diào)NR2F1，而在MCF10CA1h中，對 PTBP1進行干擾可明顯降低NR2F1的蛋白水平，提示PTBP1參與了NAS1對NR2F1的調(diào)控。事實上，在MCF10AT中，敲除PTBP1以及過表達NAS1完全阻斷了NR2F1通過NAS1表達；而在CA1h-P2中，PTBP1與NAS1敲除后，NR2F1蛋白水平恢復(fù)(Fig. 5c)，證實了PTBP1介導(dǎo)了NAS1在NR2F1調(diào)控中的作用。

進一步分析PTBP1如何調(diào)控NR2F1的表達，在排除了PTBP1調(diào)控NR2F1啟動子活性的可能性之后，通過RIP和融合蛋白免疫沉淀試驗均發(fā)現(xiàn)NR2F1 mRNA與PTBP1結(jié)合(Fig. 5e)，顯示了PTBP1蛋白、NAS1 RNA和NR2F1 mRNA之間的相互作用。此外，作者還發(fā)現(xiàn)NAS1敲低可破壞PTBP1和NR2F1 mRNA的結(jié)合(Fig. 5f)。而抑制PTBP1后，拉下的NAS1中NR2F1 mRNA的下調(diào)無明顯變化(Fig. 5g )。因此，這些數(shù)據(jù)表明NAS1促進PTBP1和NR2F1 mRNA的結(jié)合。

接下來，作者分析了NAS1和PTBP1如何調(diào)控NR2F1 mRNA。由于在NR2F1 mRNA的5'UTR中發(fā)現(xiàn)了多個多嘧啶區(qū)域，推測PTBP1和NAS1可能促進了NR2F1- 5'UTR的IRES功能。為了驗證這一假設(shè)，作者構(gòu)建了IRES活性報告質(zhì)粒(Fig. 5h)以及NR2F1-5'UTR段(Fig. 5h)，RES報告分析顯示UTR具有輕微的啟動翻譯的活性，而5 'UTR-PT表現(xiàn)出更強的IRES活性。相反,5'UTR-GC完全沒有IRES活性(圖5i)，接下來，作者通過pGL3報告基因評估了這些區(qū)域的潛在啟動子活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然5′UTR 和5′UTR-GC檢測到輕微的啟動活性，但5′UTR-PT沒有啟動轉(zhuǎn)錄的能力，表明NR2R1 5'UTR的多嘧啶區(qū)具有先天的IRES活性，而下游富含gc的序列的存在阻礙了這種活性的mRNA翻譯。

有趣的是，通過蛋白-RNA,RNA-RNA相互作用預(yù)測工具(catRAPID61和IntaRNA62-65)進行分析，發(fā)現(xiàn)PTBP1和NAS1分別與NR2F1-5 '的多嘧啶和gc富集區(qū)域結(jié)合(Fig. 5j)。通過RIP和pull down實驗對NR2F1 mRNA不同區(qū)域的進行RIP和RNA下拉分析，證實了NAS1 RNA優(yōu)先結(jié)合5 'utr-gc(Fig. 5k), PTBP1只與5′UTR-P特異結(jié)合(Fig. 5l)。而且抑制PTBP1導(dǎo)致了5'UTR-PT IRES活性受到抑制(Fig. 5m)。反之，NAS1過表達可增強IRES 5'UTR的活性，但這種調(diào)節(jié)依賴于GC富集。5'UTR-PT較強的IRES活性不受NAS1的影響(圖5n)。由此可見，PTBP1與NR2F1-5 ' utr的多嘧啶區(qū)域結(jié)合啟動IRES活性，但NR2F1的翻譯過程受到下游富gc區(qū)域的抑制。這種抑制可以通過與NAS1的結(jié)合而解除，可能是通過重塑在這個富含gc的區(qū)域形成的RNA結(jié)構(gòu)(Fig. 5o)。

Fig 5 NAS1和PTBP1共同增強NR2F1-5'UTR的IRES功能

6. NR2F1抑制ΔNp63的表達

為進一步分析NAS1-NR2F1促進腫瘤細胞休眠的下游分子事件，通過對NAS1敲低或NR2F1過表達的癌細胞進行RNA測序分析。發(fā)現(xiàn)了miR-205和發(fā)生了miR-205的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TP63基因變異的ΔNp63。已有報道闡明了miR-205通過靶向ZEB1和SIP168抑制腫瘤細胞EMT。

作者分析發(fā)現(xiàn)，miR-205和ΔNp63的表達均被NAS1和NR2F1顯著抑制(Fig. 6a),，這一點被qPCR和WB檢測進一步證實(Fig.6b–d)。

因此，作者對ΔNp63在NAS1誘導(dǎo)EMT和抑制腫瘤進行研究。在CA1h-P2細胞中，NAS1敲低的同時抑制ΔNp63，能逆轉(zhuǎn)MET表型，恢復(fù)間質(zhì)形態(tài)和標志物表達的(Fig. 6e)。而干擾ΔNp63也有效抑制了因NAS1基因敲低而造成腫瘤球形成能力(Fig. 6f)。GSEA分析發(fā)現(xiàn)NR2F1對ΔNp63的下游基因有抑制作用(Fig. 6g),。ChIP-qPCR分析顯示NR2F1在ΔNp63啟動子上結(jié)合(Fig.6h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明NR2F1通過抑制ΔNp63的表達介導(dǎo)了NAS1的休眠促進功能。處理時，在CA1h-P2細胞中，抑制miR-205恢復(fù)了NAS1敲低造成的間葉細胞表型，NAS1過表達MCF10AT將會誘導(dǎo)細胞上皮恢復(fù)(Fig. 6i)。因此，miR-205作用于NAS1-NR2F1 -ΔNp63信號軸下游調(diào)控細胞EMT。

Fig 6 NR2F1通過抑制ΔNp63轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)NAS1在休眠中的作用

7. 在乳腺腫瘤中，NAS1與NR2F1、EMT標記物和轉(zhuǎn)移減少相關(guān)

最后，作者評估了NAS1的表達在乳腺腫瘤樣本中的臨床意義。首先，在乳腺癌患者的腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)NAS1 RNA與NR2F1蛋白水平呈正相關(guān)(Fig. 7a), 驗證了NAS1在調(diào)控中的作用NR2F1。然后，通過對RNA測序數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)了NAS1與大量emt相關(guān)基因顯著相關(guān)(Fig. 7b)。在乳腺癌陰性患者中，NAS1也與之前報道的M-BCSC和EMT基因標記的富集以及E-BCSC標記的缺失呈正相關(guān)(Fig. 7c)。其次，從齊魯醫(yī)院收集的89例乳腺癌樣本分析發(fā)現(xiàn)腫瘤NAS1高表達與較低的轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)風險相關(guān)(Fig. 7d, e)。

同時，Kaplan-Meier Plotter臨床數(shù)據(jù)庫74的分析也顯示了NAS1改善了乳腺癌復(fù)發(fā)情況。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)敲低NAS1或過表達NR2F1都會促進 NAS1基因表達，與加速或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)(Fig. 7f, g)。最后，與正常乳腺組織相比，乳腺腫瘤中NAS1的下調(diào)（Fig. 10g），驗證了NAS1抑制致瘤性的作用。

Fig 7 NAS1的表達在乳腺腫瘤中及其臨床意義

本研究闡明了間充質(zhì)腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中的休眠機制。

1.        Liu, Y., et al., Author Correction: Long non-coding RNA NR2F1-AS1 induces breast cancer lung metastatic dormancy by regulating NR2F1 and DeltaNp63. Nat Commun, 2021. 12(1): p. 5973.