復(fù)發(fā)性膀胱癌中癌干細(xì)胞維持和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究
由于治療抵抗和高復(fù)發(fā)率，膀胱癌治療仍然是一個(gè)重大的臨床挑戰(zhàn)。分析腫瘤內(nèi)異質(zhì)性可以揭示膀胱癌復(fù)發(fā)的分子機(jī)制。2021年9月發(fā)表于“CLINICAL CANCER RESEARCH”（IF=12.531）的文章“Single-Cell Analyses Reveal Mechanisms of Cancer Stem Cell Maintenance and Epithelial–Mesenchymal Transition in Recurrent Bladder Cancer”對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道。我們的研究生成了一個(gè)由54971個(gè)單細(xì)胞組成的綜合癌細(xì)胞圖譜，并確定了不同的細(xì)胞亞群。我們發(fā)現(xiàn)膀胱癌復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤干細(xì)胞亞群豐富，EZH2表達(dá)升高。我們進(jìn)一步定義了一種亞群特異性分子機(jī)制，其中EZH2維持H3K27me3介導(dǎo)的NCAM1基因抑制，從而使細(xì)胞侵襲性和干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序失活。此外，我們闡明了臨床樣本中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的譜，并揭示了與膀胱癌亞型相關(guān)的不同EMT特征。我們發(fā)現(xiàn)TCF7促進(jìn)EMT與scATAC-seq分析相一致。我們的研究和分析方法為膀胱癌研究領(lǐng)域中腫瘤干細(xì)胞和EMT的進(jìn)一步研究提供了豐富的資源。
技術(shù)路線
結(jié)果
1）膀胱癌的單細(xì)胞RNA和ATAC-seq
本研究將膀胱癌患者分為低危組、高危組和復(fù)發(fā)組(圖1A)。根據(jù)美國(guó)泌尿外科協(xié)會(huì)(AUA)/泌尿腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)(SUO)指南對(duì)低危和高危NMIBC進(jìn)行分層，并將MIBC樣本分為高危組。在去除低質(zhì)量的細(xì)胞后，我們總共獲得了37000個(gè)用于scRNA-seq的細(xì)胞(圖1B和C)和17571個(gè)用于scATAC-seq的細(xì)胞(圖1D-F)。我們整合了低風(fēng)險(xiǎn)、高風(fēng)險(xiǎn)和復(fù)發(fā)性膀胱癌的數(shù)據(jù)，并通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記基因確定了scRNA-seq中的主要細(xì)胞群。我們還確定了scATAC-seq數(shù)據(jù)中的主要細(xì)胞亞群，并觀察到標(biāo)記基因的開(kāi)放染色質(zhì)（圖1E）。scRNA-seq和ATAC-seq檢索到的大多數(shù)細(xì)胞是非免疫細(xì)胞（圖1C和F）。與低風(fēng)險(xiǎn)和復(fù)發(fā)性膀胱癌相比，我們通過(guò)scRNA-seq和scATAC-seq在高風(fēng)險(xiǎn)膀胱癌中檢測(cè)到更多的免疫細(xì)胞（圖1F）。我們?cè)?/span>scATAC-seq數(shù)據(jù)中觀察到的免疫細(xì)胞組分少于scRNA-seq數(shù)據(jù)（圖1C和F）。
2）膀胱癌非免疫細(xì)胞的高度異質(zhì)性
我們首先根據(jù)簇特異性DE基因?qū)⒎敲庖呒?xì)胞（CD45陰性）重新分類為17個(gè)簇（圖2A和B）。在所有簇中，鑒定出9個(gè)基底細(xì)胞簇（簇0、2、3、5、8、10、13、14），高度表達(dá)角蛋白基因，如KRT5、KRT13、KRT17和KRT19。簇1、6、9和15被指定為表達(dá)UPK3A、UPK1A、UPK2、UPK1B、UPK3B和EPCAM的上皮細(xì)胞。聚類11中血管內(nèi)皮細(xì)胞富集，高表達(dá)CDH5和PECAM1。成纖維細(xì)胞(簇4、7、12和16)高表達(dá)膠原基因，如COL1A1、COL1A2和COL3A1。最近，據(jù)報(bào)道，胰腺癌和膀胱癌中的成纖維細(xì)胞分為兩種不同類型，其中一種表現(xiàn)出多種細(xì)胞因子和趨化因子的強(qiáng)烈表達(dá)[稱為“炎性癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（iCAF）]，另一種類似于肌成纖維細(xì)胞（mCAF）。我們對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了重新分類，發(fā)現(xiàn)表達(dá)RGS5的iCAF和表達(dá)PDGFRA的mCAF也存在于膀胱癌中（圖2C和D）。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)這些iCAF和mCAF不是腫瘤特異性的，也可以在健康組織中檢測(cè)到（圖2D）。在注釋了膀胱癌的細(xì)胞亞型后，我們接下來(lái)評(píng)估了這些膀胱癌細(xì)胞類型是否能夠反映一致的分子分類。我們將單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與1750名患者的MIBC轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)管腔乳頭狀、管腔非特異性、管腔不穩(wěn)定、基質(zhì)豐富和基底/鱗狀亞型與我們數(shù)據(jù)集的細(xì)胞類型相對(duì)應(yīng)（圖2E）。當(dāng)將TCGA細(xì)胞分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)與一致的分子亞型相關(guān)聯(lián)時(shí)，我們注意到TCGA/BCLA隊(duì)列可以重現(xiàn)我們的scRNA序列數(shù)據(jù)中確定的細(xì)胞類型（圖2F）。
3）scRNA-seq顯示復(fù)發(fā)性膀胱癌中豐富的異質(zhì)性CSC亞群
我們接下來(lái)檢查了膀胱癌干細(xì)胞（BCSC）標(biāo)記物CD44和ALDH1A1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨准?xì)胞簇2和5中富集，表明BCSC可能來(lái)源于基底細(xì)胞。這些細(xì)胞的重新聚集產(chǎn)生了8個(gè)亞群（圖3A）。與健康、低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)人群相比，復(fù)發(fā)性膀胱癌亞群0、2、6和8更為豐富（圖3B）。BCSCs的調(diào)控可分為兩組，其中一組被CHD2、SIN3A、YY1和KDM5B富集（圖3C）。KDM5B是組蛋白H3K4me3的去甲基化酶，在包括膀胱癌在內(nèi)的多種人類癌癥中都有過(guò)表達(dá)的報(bào)道。此外，KDM5B的磷酸化可能調(diào)節(jié)其在乳腺癌中的活性。另一組BCSC調(diào)控子包括SOX15、ATF3、KLF10和EZH2（圖3C）。EZH2催化H3K27me3，從而抑制靶基因表達(dá)，EZH2的高表達(dá)也與膀胱癌的進(jìn)展有關(guān)。因此，我們假設(shè)EZH2在BCSCs中起關(guān)鍵作用，從而促進(jìn)膀胱癌復(fù)發(fā)。
為了深入了解EZH2和H3K27甲基化在膀胱癌中的作用，我們?cè)诎螂装┘?xì)胞系中使用shRNA構(gòu)建了兩種不同的shRNA構(gòu)建物，構(gòu)建了2個(gè)獨(dú)立穩(wěn)定的EZH2敲除（KD）細(xì)胞系（圖3D）。值得注意的是，與野生型（WT）細(xì)胞相比，EZH2 KD細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移能力受損（圖3E-H）。此外，將EZH2 KD細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤比WT細(xì)胞更小（圖4A和B）。與shRNA對(duì)照異種移植物相比，EZH2 KD異種移植物減少了細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67染色，但增加了細(xì)胞死亡標(biāo)記物TUNEL染色（圖4C-E）?？傊?，EZH2在尿路上皮癌細(xì)胞的干細(xì)胞獲得中起著關(guān)鍵作用。
4）EZH2塑造膀胱癌細(xì)胞粘附和干細(xì)胞基因的表觀遺傳景觀
我們進(jìn)行了CUT&Tag檢測(cè)和ATAC-seq檢測(cè)WT和EZH2 KD細(xì)胞中的H3K27me3, H3K27ac和可訪問(wèn)染色質(zhì)(圖5A)。EZH2的耗盡導(dǎo)致68%的H3K27me3峰的損失，這與其H3K27me3的催化活性相一致(圖5A)。此外，EZH2的KD增加了55%的H3K27ac峰，而EZH2缺失時(shí)，可接近的染色質(zhì)峰增加了29%?？傮w而言，EZH2的缺失與H3K27ac的顯著增加和開(kāi)放染色質(zhì)的輕微增加是一致的，這是活性基因轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記(圖5A)。
接下來(lái)，我們確定了EZH2 KD細(xì)胞中易接近染色質(zhì)的相關(guān)功能。我們將可接近的染色質(zhì)峰分為WT特異性、一致性和EZH2特異性峰（圖5B）。與這些峰值相關(guān)的GO注釋表明，它們與細(xì)胞粘附、EGFR信號(hào)通路、干細(xì)胞分化和組織重塑有關(guān)（圖5B）。為了確定膀胱癌中EZH2調(diào)節(jié)的TFs，我們進(jìn)行DNA足跡分析。我們?cè)贓ZH2耗盡后觀察到一些差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的TFs，如TCF4、TCFL5、CEBPB等，提示EZH2可能通過(guò)這些因子調(diào)控細(xì)胞的干性（圖5C）。
為了進(jìn)一步了解EZH2在膀胱癌復(fù)發(fā)中的機(jī)制，我們進(jìn)行了RNA-seq，發(fā)現(xiàn)EZH2缺失后，大量據(jù)報(bào)道維持癌細(xì)胞干細(xì)胞的粘蛋白基因被下調(diào)（圖5D），表明EZH2可能通過(guò)粘蛋白基因維持癌細(xì)胞干細(xì)胞。此外，EZH2的缺失導(dǎo)致NCAM1的表達(dá)顯著增加。EZH2缺失后，NCAM1啟動(dòng)子和基因體中的H3K27me3水平顯著降低，表明EZH2對(duì)該基因的直接調(diào)控（圖5E）?？傊?，EZH2的KD減弱干細(xì)胞基因的表達(dá)，并直接激活NCAM1轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞粘附。
非免疫細(xì)胞簇1、6、9和15為上皮細(xì)胞(圖2A)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們將這些細(xì)胞分為風(fēng)險(xiǎn)低、風(fēng)險(xiǎn)高和復(fù)發(fā)性膀胱癌亞型，以計(jì)算重建假時(shí)間路徑(圖6A)。我們?cè)诿總€(gè)條件下鑒定了具有偽時(shí)間路徑的共表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)誘發(fā)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，如TCF3、TCF4、TWIST1、SNAI1和FOXC2，都與EMT軌跡相關(guān)(圖6B)。這些誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT。有趣的是，TCF7的表達(dá)模式與誘導(dǎo)EMT的TFs相似(圖6B)。為了進(jìn)一步了解TF在EMT中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們分析了上皮細(xì)胞的scATAC-seq數(shù)據(jù)，確定了7個(gè)亞群(圖6C)。各亞群的DNA足跡顯示，TCF7基序在0 ~ 3亞群中與其他誘導(dǎo)EMT的TFs一起富集，提示TCF7可能與SNAI1/2、TCF3/4、ZEB1等其他誘導(dǎo)EMT的TFs調(diào)控和誘導(dǎo)EMT的方式相同(圖6 D)。
為了驗(yàn)證TCF7在膀胱癌中的功能，我們?cè)诎螂装┘?xì)胞中使用shRNA介導(dǎo)的TCF7 KD（圖7A）。TCF7的缺失導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力受損（圖7B和C），表明TCF7 KD減弱了這些細(xì)胞中的EMT。為了深入了解TCF7在EMT中的功能，我們?cè)赥CF7 KD細(xì)胞中進(jìn)行了大量RNA測(cè)序。GO富集分析表明TCF7靶基因與EMT標(biāo)志基因相關(guān)（圖7D）。與TCF7在EMT中的作用一致，清除TCF7可阻斷裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)(圖7E)。TCF7 KD腫瘤在體內(nèi)表現(xiàn)出細(xì)胞增殖受損和凋亡細(xì)胞死亡增強(qiáng)（圖7F-H）?？傊?，這些結(jié)果表明TCF7可以啟動(dòng)EMT并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。
結(jié)論：我們使用scRNA-seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，使用scATAC進(jìn)行染色質(zhì)染色質(zhì)景觀分析，并生成了一個(gè)包含50000多個(gè)膀胱癌細(xì)胞的大型數(shù)據(jù)集，這些細(xì)胞來(lái)自13名膀胱癌患者，分為低風(fēng)險(xiǎn)、高風(fēng)險(xiǎn)和復(fù)發(fā)組?；谶@個(gè)大數(shù)據(jù)集，我們描述了EZH2在CSC亞群中的功能，以及TCF7在EMT中的功能。我們相信我們的研究和分析方法為CSCs和EMT在膀胱癌研究領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了豐富的資源。
參考文獻(xiàn)：Wang H, Mei Y, Luo C, et al. Single-Cell Analyses Reveal Mechanisms of Cancer Stem Cell Maintenance and Epithelial–Mesenchymal Transition in Recurrent Bladder Cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2021. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-4796