lncRNA MELTF-AS1-骨肉瘤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)

骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥，常見于兒童和青少年。對(duì)于轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤仍然缺乏有效的治療方法。lncRNA在骨肉瘤中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。在這里，我們通過(guò)分析骨肉瘤組織的測(cè)序數(shù)據(jù)，識(shí)別出轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中異常表達(dá)的lncRNA，并選擇上調(diào)的lncRNA MELTF-AS1進(jìn)行詳細(xì)研究。qRT-PCR分析顯示MELTF-AS1在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)增高，MELTF-AS1高表達(dá)提示骨肉瘤患者預(yù)后不良。MELTFAS1在骨肉瘤中的高表達(dá)部分是由于RREB1的轉(zhuǎn)錄激活。transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)和尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明，敲除MELTF-AS1可抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。此外，RNA下拉實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RNA免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MELTF-AS1可以通過(guò)與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達(dá)。我們的研究表明MELTF-AS1通過(guò)上調(diào)MMP14在骨肉瘤中起促轉(zhuǎn)移基因的作用，可能成為骨肉瘤治療和診斷的潛在靶點(diǎn)。本文于2021年8月發(fā)表在“MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS”（IF:8.886）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MELTF-AS1在骨肉瘤中上調(diào)，并與骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)

通過(guò)分析TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)中骨肉瘤組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們首先發(fā)現(xiàn)了在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中異常表達(dá)的lncRNA(圖1A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組織相比，MELTF-AS1在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著升高。此外，與測(cè)序結(jié)果一致的是，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中MELTF-AS1的表達(dá)水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織(圖1B和1C)。MELTF-AS1高表達(dá)的骨肉瘤患者預(yù)后較差(圖1D)。細(xì)胞的qRT-PCR分析顯示MELTF-AS1在骨肉瘤細(xì)胞(SaoS-2、143B、MG63、U2-OS、HOS、NIH 3T3)中的表達(dá)明顯高于成骨細(xì)胞hFoB1.19。此外，MELTF-AS1在兩種尤文氏肉瘤細(xì)胞系(a -673和Hs863.T)中的表達(dá)水平并不明顯高于hFoB1.19，說(shuō)明MELTF-AS1可能僅在骨肉瘤中發(fā)揮特定作用(圖1E)。

2）RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄

我們探討了骨肉瘤中MELTF-AS1表達(dá)升高的原因。我們使用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能結(jié)合到MELTF-AS1啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。在這些候選轉(zhuǎn)錄因子中，RREB1得分較高。沉默RREB1后，骨肉瘤細(xì)胞中MELTF-AS1的表達(dá)水平顯著降低(圖2A)，過(guò)表達(dá)RREB1后，MELTF-AS1的表達(dá)水平顯著升高(圖2B)。此外，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，RREB1在骨肉瘤組織中明顯升高，且在有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中表達(dá)水平高于無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織(圖2C)。免疫組化(IHC)檢測(cè)結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中RREB1蛋白水平的變化趨勢(shì)與RNA水平一致(圖2D)。此外，利用該RREB1抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該抗體可以直接結(jié)合MELTF-AS1的啟動(dòng)子區(qū)域(圖2E)。當(dāng)RREB1過(guò)表達(dá)時(shí)，熒光素酶的相對(duì)活性顯著升高，但在啟動(dòng)子中RREB1的結(jié)合區(qū)域被刪除后，過(guò)表達(dá)RREB1并不引起熒光素酶活性的變化(圖2F)。

3）MELTF-AS1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)移

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，敲除MELTF-AS1后，骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低(圖3A)。劃痕創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，MELTF-AS1沉默后，骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力顯著下降(圖3B)。靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型的結(jié)果表明，抑制MELTF-AS1后，骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力減弱。如圖3C(左圖)所示，MELTF-AS1沉默組(sh MELTF-AS1)骨肉瘤細(xì)胞形成的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。sh MELTF-AS1組小鼠的生存時(shí)間也比對(duì)照組長(zhǎng)(圖3C，右圖)。免疫熒光檢測(cè)顯示，沉默骨肉瘤細(xì)胞中MELTF-AS1后，Vimentin蛋白水平降低，E-cadherin蛋白水平升高(圖3D)。波形蛋白高度擴(kuò)張，與轉(zhuǎn)移增加呈正相關(guān)。E-Cadherin在上皮細(xì)胞中高表達(dá)，與減少轉(zhuǎn)移有關(guān)。基因集富集分析(GSEA)顯示MELTF-AS1在骨肉瘤組織中的高表達(dá)與ALONSO_METASTASIS_EMT_UP和HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION基因集相關(guān)(圖3E)。以上結(jié)果表明MELTF-AS1在體內(nèi)外均能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并影響骨肉瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)途徑。

4）MELTF-AS1在骨肉瘤中作為miR-485-5p的ceRNA

熒光素原位雜交(FISH)檢測(cè)顯示MELTF-AS1主要分布于骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖4A)。亞細(xì)胞分離的qRT-PCR分析也顯示MELTF-AS1主要位于細(xì)胞質(zhì)中(圖4B)?？紤]到細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA可以作為ceRNA，我們使用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)microRNA與MELTF-AS1的潛在結(jié)合。接下來(lái)，我們用生物素標(biāo)記的MELTF-AS1探針進(jìn)行RNA下拉實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證哪些microRNA可以與MELTF-AS1結(jié)合。如圖4C所示，miR485-5p和miR-665可以直接與MELTF-AS1結(jié)合。由于miR-485-5p與MELTF-AS1的結(jié)合豐度較高，我們選擇其作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。在143B細(xì)胞中MELTF-AS1沉默后miR-485-5p表達(dá)顯著增加(圖4D)。相反，當(dāng)MELTF-AS1過(guò)表達(dá)時(shí)，miR-485-5p的表達(dá)顯著降低(圖4E)。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MELTF-AS1和miR-485-5p均可直接結(jié)合Argonaute 2 (AGO2)蛋白(圖4F)。我們基于MELTF-AS1和miR-485-5p的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建了雙熒光素酶報(bào)告基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-485-5p可顯著降低熒光素酶活性。然而，如果MELTF-AS1和miR-485-5p的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，過(guò)表達(dá)miR-485-5p對(duì)熒光素酶活性幾乎沒有影響(圖4G)。骨肉瘤組織的qRT-PCR分析顯示，miR-485-5p在骨肉瘤中表達(dá)降低，在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中miR-485-5p表達(dá)降低(圖4H)。

5）MELTF-AS1通過(guò)與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達(dá)

我們使用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)miR-4855p的靶基因，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP14是miR-485-5p的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-485-5p可直接與MMP14的3’UTR結(jié)合，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，miR-485-5p對(duì)熒光素酶活性沒有影響(圖5A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞中MELTF-AS1沉默后，MMP14的RNA水平下降，同時(shí)沉默MELTF-AS1并轉(zhuǎn)染miR485-5p抑制劑后，下降的MMP14又恢復(fù)到正常水平(圖5B)。此外，骨肉瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MELTFAS1可導(dǎo)致MMP14表達(dá)增加，但如果過(guò)表達(dá)MELTF-AS1同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-485-5p，則MMP14表達(dá)減弱(圖5C)。western blot結(jié)果顯示，蛋白水平的變化與RNA水平的變化一致(圖5D)。骨肉瘤組織中MMP14的RNA水平升高，且在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中MMP14的水平高于未轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織(圖5E)。骨肉瘤組織中相關(guān)分析顯示miR485-5p的表達(dá)與MELTF-AS1和MMP14的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而MELTF-AS1的表達(dá)與MMP14的表達(dá)呈正相關(guān)(圖5F)。綜上所述，MELTF-AS1吸附細(xì)胞質(zhì)中的miR-485-5p，作為ceRNA促進(jìn)MMP14表達(dá)。

6）MELTF-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)MMP14促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移

transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MELTF-AS1可提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。過(guò)表達(dá)MELTF-AS1，而過(guò)表達(dá)miR-485-5p或抑制MMP14，削弱了MELTF-AS1過(guò)表達(dá)引起的轉(zhuǎn)移能力的增加(圖6A)。免疫熒光分析顯示，過(guò)表達(dá)MELTF-AS1增加了Vimentin的表達(dá)，降低了E-cadherin的表達(dá)，共轉(zhuǎn)染miR-485-5p或MMP14 siRNA消除了MELTF-AS1引起的變化(圖6B)。western blot顯示MELTF-AS1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了MMP14下游靶點(diǎn)VEGF-A的表達(dá)。同樣，過(guò)表達(dá)miR-485-5p或抑制MMP14可減弱MELTF-AS1誘導(dǎo)的VEGF-A升高(圖6C)。上述結(jié)果表明MELTF-AS1通過(guò)調(diào)控MMP14影響轉(zhuǎn)移相關(guān)通路和蛋白，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移(圖7)。

   結(jié)論：MELTF-AS1是骨肉瘤的促轉(zhuǎn)移lncRNA。MELTF-AS1在伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤中表達(dá)升高，其高表達(dá)與骨肉瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。MELTF-AS1通過(guò)調(diào)控MMP14的表達(dá)增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。我們的研究表明MELTF-AS1可能是骨肉瘤患者潛在的治療靶點(diǎn)。

   參考文獻(xiàn)：Ding L, Liu T, Qu Y, Kang Z, Guo L, Zhang H, Jiang J, Qu F, Ge W, Zhang S. lncRNA MELTF-AS1 facilitates osteosarcoma metastasis by modulating MMP14 expression. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Aug 26;26:787-797. doi: 10.1016/j.omtn.2021.08.022. PMID: 34729248; PMCID: PMC8526484.