中性粒細(xì)胞外泌體miR-30d-5p在膿毒癥相關(guān)急性肺損傷中誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡

多形核中性粒細(xì)胞（PMN）在膿毒癥相關(guān)急性肺損傷（ALI）中起重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PMN衍生的外泌體是一種新的亞細(xì)胞實(shí)體，在PMN引發(fā)的炎癥和組織損傷之間起著基礎(chǔ)性的聯(lián)系。然而，PMN衍生的外泌體在膿毒癥相關(guān)ALI中的作用及其潛在機(jī)制尚不清楚。目前有研究表明，來(lái)自中性粒細(xì)胞的外體miR-30d-5p通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化和引發(fā)巨噬細(xì)胞焦亡而參與膿毒癥相關(guān)的ALI。該研究于2021年10月發(fā)表在《Crit Care》，IF：9.097。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.   TNF-Exo通過(guò)影響體內(nèi)M1巨噬細(xì)胞活化和焦亡誘導(dǎo)肺損傷

TNF-α是一種有效的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)因子，也是與敗血癥相關(guān)ALI中先天免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，常用于激活中性粒細(xì)胞。因此，用PBS（PBS-Exo）處理或用TNF-α（TNF-Exo）體外刺激C57BL/6J小鼠的中性粒細(xì)胞用來(lái)分離外泌體。熒光成像顯示，注射TNF-Exo后，TNF-Exo在肺組織中積聚（圖1a）。與PBS-Exo相比，TNF-Exo給藥后小鼠肺部觀察到組織學(xué)病變（圖1b）。同時(shí)，肺組織中的促炎介質(zhì)（iNOS、IL-1β和TNF-α）高度表達(dá)，局部M1巨噬細(xì)胞（iNOS+F4/80+細(xì)胞）數(shù)量顯著增加（圖1c，d），表明TNF-Exo誘導(dǎo)的肺炎癥與巨噬細(xì)胞炎癥活動(dòng)一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)TNF-Exo顯著增加了腹腔巨噬細(xì)胞（PMφ）中M1巨噬細(xì)胞（CD11c+CD206-）和死亡細(xì)胞（膜聯(lián)蛋白V+PI+）的比例（圖1e，f）。為了進(jìn)一步確定PMφ死亡的類(lèi)型，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMφ的核碎裂、caspase-1激活（焦亡的特征），結(jié)果顯示TNF-Exo注射后24小時(shí)PMφ的焦亡率約為8%（圖1g）。所有這些數(shù)據(jù)表明，所有這些數(shù)據(jù)表明，TNF-Exo在體內(nèi)可能由于M1巨噬細(xì)胞的活化和焦亡而誘發(fā)肺部炎癥。

圖1 TNF-Exo在體內(nèi)通過(guò)影響M1巨噬細(xì)胞的活化和焦亡誘導(dǎo)肺損傷

2.   在體外共培養(yǎng)模型中，TNF-Exo通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞激活并引發(fā)巨噬細(xì)胞焦亡

使用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，將巨噬細(xì)胞與PMN衍生的外泌體共培養(yǎng)，以進(jìn)一步證實(shí)體內(nèi)動(dòng)物研究的結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在原代細(xì)胞還是巨噬細(xì)胞細(xì)胞系中，TNF-Exo都能促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化（圖2a-c）。然而，TNF-Exo并不能直接促進(jìn)巨噬細(xì)胞死亡或焦亡；添加ATP/nigericin后，TNF-Exo誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的焦亡性細(xì)胞死亡顯著上調(diào)（圖2d-e）。激活的NLRP3炎性體剪接IL-1β前體以進(jìn)行成熟和分泌，并切割GSDMD以引發(fā)焦亡。通過(guò)Western blot和ELISA評(píng)估，TNF-Exo+ATP組或nigericin組的GSDMD n端和IL-1β的分泌增加（圖2f-g）。此外，通過(guò)RT-qPCR測(cè)定，TNF-Exo增加巨噬細(xì)胞中NLRP3和caspase-1 mRNA的表達(dá)（圖2h-i）。這些數(shù)據(jù)表明，TNF-Exo僅作為上調(diào)NLRP3炎性體表達(dá)的啟動(dòng)信號(hào)，而第二個(gè)信號(hào)，如ATP或nigericin，則需要在體外最終誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。

圖2體外共培養(yǎng)模型中，TNF-Exo通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞激活并引發(fā)巨噬細(xì)胞焦亡

3.   PMN來(lái)源外泌體的miRNA分析

了解膿毒癥休克患者的外泌體可以傳遞致病途徑相關(guān)的miRNAs，這可能是膿毒癥期間細(xì)胞間通信的一種新機(jī)制。隨后對(duì)pmn來(lái)源的外泌體進(jìn)行了miRNAs篩選，檢測(cè)到26個(gè)miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)，與PBS-Exo相比，TNF-Exo的表達(dá)量增加了兩倍（圖3a）。富集通路分析也對(duì)這26個(gè)miRNAs進(jìn)行了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)最富集的通路分析，數(shù)據(jù)顯示NF-κB信號(hào)通路在20條最富集的通路中（圖3b）。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)miR- 30d-5p的表達(dá)與NF-κB信號(hào)通路呈正相關(guān)，且RT-qPCR發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p在TNF-Exo中的表達(dá)明顯高于PBS-Exo（圖3c）。TNF-α刺激后PMNs中的miR-30d-5p水平下降，這表明miR-30d-5p從細(xì)胞室轉(zhuǎn)移到外泌體（圖3d）。用TNF-Exo體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞顯示出更高水平的miR-30d-5p（圖3e）。這些結(jié)果表明，TNF-α可以增強(qiáng)miR-30d-5p在PMN外泌體中的裝載并轉(zhuǎn)移到受體巨噬細(xì)胞中。因此，推測(cè)TNF-Exo可能將miR- 30d-5p轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中，進(jìn)而激活NF-κ b信號(hào)通路。

圖3 PMN來(lái)源外泌體的miRNA分析

4.   TNF-Exo通過(guò)miR-30d-5p激活巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路

為了驗(yàn)證上述假設(shè)，在與TNF-Exo培養(yǎng)之前，用miR-30d-5p抑制劑轉(zhuǎn)染Raw264.7巨噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制劑可逆轉(zhuǎn)由TNF-Exo誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物和促炎細(xì)胞因子的上調(diào)（圖4a-c）。此外，抑制miR-30d-5p顯著降低了TNF-Exo處理的受體巨噬細(xì)胞中NF-κB p-p65蛋白的表達(dá)（圖4d）。此外，在用TNF-Exo培養(yǎng)之前，用miR-30d-5p抑制劑處理Raw264.7巨噬細(xì)胞可降低NLRP3和caspase-1的mRNA水平（圖4e）。轉(zhuǎn)染miR-30d-5p抑制劑對(duì)TNF-Exo加ATP的caspase-1激活有顯著的抑制作用（圖4f-g）。TNF-Exo+ATP刺激上調(diào)的GSDMD n端也被miR-30d-5p抑制劑抑制（圖4h）。這些數(shù)據(jù)表明，外泌體miR-30d-5p通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞活化，啟動(dòng)巨噬細(xì)胞焦亡。

圖4 TNF-Exo通過(guò)miR-30d-5p激活巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路

5.  外泌體miR-30d-5p通過(guò)靶向SOCS-1和SIRT1激活巨噬細(xì)胞NF-κB

生物信息學(xué)分析表明，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子SOCS-1和sirtuin 1可能是miR-30d-5p的靶基因，也是NF-κB信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子。通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)的那樣，miR-30d-5p可能保留了SOCS-1和SIRT1的3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)（圖5a）。雙熒光素酶報(bào)告分析，發(fā)現(xiàn)SOCS-1/SIRT1 3’-UTR WT組中的miR-30d-5p過(guò)度表達(dá)顯著降低了熒光素酶活性，但3’-UTR Mut組中沒(méi)有（圖5b）。在Raw264.7巨噬細(xì)胞中，miR-30d-5p過(guò)表達(dá)抑制了SOCS-1和SIRT1的mRNA和蛋白水平（圖5c-d）。所有這些結(jié)果都表明SOCS-1和SIRT1是miR-30d-5p的直接靶基因。為了確定外體miR-30d-5p是否靶向巨噬細(xì)胞中的SOCS-1/SIRT1，研究發(fā)現(xiàn)TNF外泌體處理的巨噬細(xì)胞中SOCS-1和SIRT1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均降低（圖5e–f），而miR-30d-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)了SOCS-1和SIRT1的表達(dá)（圖5g）。研究表明SIRT1通過(guò)降低NF-κB p65亞基賴氨酸310的乙?；絹?lái)降低NF-κB活性。在這個(gè)研究中TNF-Exo后p65賴氨酸310乙?；鰪?qiáng)（圖5f），而抑制miR-30d-5p后p65賴氨酸310乙酰化減弱（圖5g）。這些結(jié)果表明，外泌體miR-30d-5p靶向巨噬細(xì)胞中的SOCS-1和SIRT1，隨后通過(guò)增加p65賴氨酸310的乙?；饔眉せ?/span>NF-κB。

圖5外泌體miR-30d-5p通過(guò)靶向SOCS-1和SIRT1激活巨噬細(xì)胞NF-κB

6.   抑制miR-30d-5p可減輕TNF Exo或CLP誘導(dǎo)的肺損傷

在體內(nèi)研究miR-30d-5p在TNF-Exo中的功能作用。發(fā)現(xiàn)注射TNF Exo后，肺組織中的miR-30d-5p表達(dá)顯著增加（圖6a）。在注射TNF-Exo之前，通過(guò)小鼠尾靜脈給予miR-30d-5p抑制劑或置位陰性對(duì)照，并檢測(cè)肺組織中促炎細(xì)胞因子和NLRP3炎性體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在TNF-Exo給藥后，miR-30d-5p抑制劑顯著降低了IL-1β、iNOS、NLRP3、caspase-1mRNA的表達(dá)水平（圖6b-c）。此外，抑制miR-30d-5p可降低TNF-Exo誘導(dǎo)的肺中M1巨噬細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞死亡（圖6d，e）以及組織學(xué)損傷（圖6f）。

此外，應(yīng)用CLP小鼠模型模擬膿毒癥，進(jìn)一步證實(shí)miR-30d-5p在體內(nèi)的作用。CLP小鼠肺組織中miR-30d-5p的表達(dá)也顯著增加（圖6g）。在miR-30d-5p抑制CLP模型中，IL-6、iNOS、NLRP3 mRNA表達(dá)下降（圖6h，i），M1巨噬細(xì)胞活化和肺內(nèi)巨噬細(xì)胞死亡減少（圖6j，k）以及肺損傷減輕（圖6l）。值得注意的是，miR-30d-5p抑制的CLP小鼠的存活率顯著高于未抑制的CLP小鼠（圖6m）。所有這些數(shù)據(jù)表明，抑制miR-30d-5p可通過(guò)抑制M1巨噬細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞死亡，從而改善TNF-Exo和CLP誘導(dǎo)的肺損傷。

圖6 miR-30d-5p抑制減輕TNF-Exo或CLP誘導(dǎo)的肺損傷

主要結(jié)論：

本研究表明，PMNs來(lái)源的外泌體miR-30d-5p可以通過(guò)增強(qiáng)M1巨噬細(xì)胞極化和啟動(dòng)巨噬細(xì)胞焦亡促進(jìn)肺部炎癥。調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的交互作用，可減輕膿毒癥相關(guān)ALI期間的組織炎癥和損傷，突出了其作為膿毒癥相關(guān)ARDS治療策略的潛力（圖6n）。