中性粒細胞外泌體miR-30d-5p在膿毒癥相關急性肺損傷中誘導M1巨噬細胞極化并誘導巨噬細胞焦亡

多形核中性粒細胞（PMN）在膿毒癥相關急性肺損傷（ALI）中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明，PMN衍生的外泌體是一種新的亞細胞實體，在PMN引發(fā)的炎癥和組織損傷之間起著基礎性的聯(lián)系。然而，PMN衍生的外泌體在膿毒癥相關ALI中的作用及其潛在機制尚不清楚。目前有研究表明，來自中性粒細胞的外體miR-30d-5p通過激活NF-κB誘導M1巨噬細胞極化和引發(fā)巨噬細胞焦亡而參與膿毒癥相關的ALI。該研究于2021年10月發(fā)表在《Crit Care》，IF：9.097。

技術路線：

主要研究結果：

1.   TNF-Exo通過影響體內M1巨噬細胞活化和焦亡誘導肺損傷

TNF-α是一種有效的炎癥反應誘導因子，也是與敗血癥相關ALI中先天免疫的關鍵調節(jié)因子，常用于激活中性粒細胞。因此，用PBS（PBS-Exo）處理或用TNF-α（TNF-Exo）體外刺激C57BL/6J小鼠的中性粒細胞用來分離外泌體。熒光成像顯示，注射TNF-Exo后，TNF-Exo在肺組織中積聚（圖1a）。與PBS-Exo相比，TNF-Exo給藥后小鼠肺部觀察到組織學病變（圖1b）。同時，肺組織中的促炎介質（iNOS、IL-1β和TNF-α）高度表達，局部M1巨噬細胞（iNOS+F4/80+細胞）數(shù)量顯著增加（圖1c，d），表明TNF-Exo誘導的肺炎癥與巨噬細胞炎癥活動一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)TNF-Exo顯著增加了腹腔巨噬細胞（PMφ）中M1巨噬細胞（CD11c+CD206-）和死亡細胞（膜聯(lián)蛋白V+PI+）的比例（圖1e，f）。為了進一步確定PMφ死亡的類型，通過流式細胞術檢測PMφ的核碎裂、caspase-1激活（焦亡的特征），結果顯示TNF-Exo注射后24小時PMφ的焦亡率約為8%（圖1g）。所有這些數(shù)據(jù)表明，所有這些數(shù)據(jù)表明，TNF-Exo在體內可能由于M1巨噬細胞的活化和焦亡而誘發(fā)肺部炎癥。

圖1 TNF-Exo在體內通過影響M1巨噬細胞的活化和焦亡誘導肺損傷

2.   在體外共培養(yǎng)模型中，TNF-Exo通過NF-κB途徑促進M1巨噬細胞激活并引發(fā)巨噬細胞焦亡

使用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，將巨噬細胞與PMN衍生的外泌體共培養(yǎng)，以進一步證實體內動物研究的結果。結果發(fā)現(xiàn)，無論是在原代細胞還是巨噬細胞細胞系中，TNF-Exo都能促進巨噬細胞M1極化（圖2a-c）。然而，TNF-Exo并不能直接促進巨噬細胞死亡或焦亡；添加ATP/nigericin后，TNF-Exo誘導的巨噬細胞的焦亡性細胞死亡顯著上調（圖2d-e）。激活的NLRP3炎性體剪接IL-1β前體以進行成熟和分泌，并切割GSDMD以引發(fā)焦亡。通過Western blot和ELISA評估，TNF-Exo+ATP組或nigericin組的GSDMD n端和IL-1β的分泌增加（圖2f-g）。此外，通過RT-qPCR測定，TNF-Exo增加巨噬細胞中NLRP3和caspase-1 mRNA的表達（圖2h-i）。這些數(shù)據(jù)表明，TNF-Exo僅作為上調NLRP3炎性體表達的啟動信號，而第二個信號，如ATP或nigericin，則需要在體外最終誘導巨噬細胞焦亡。

圖2體外共培養(yǎng)模型中，TNF-Exo通過NF-κB途徑促進M1巨噬細胞激活并引發(fā)巨噬細胞焦亡

3.   PMN來源外泌體的miRNA分析

了解膿毒癥休克患者的外泌體可以傳遞致病途徑相關的miRNAs，這可能是膿毒癥期間細胞間通信的一種新機制。隨后對pmn來源的外泌體進行了miRNAs篩選，檢測到26個miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)，與PBS-Exo相比，TNF-Exo的表達量增加了兩倍（圖3a）。富集通路分析也對這26個miRNAs進行了信號轉導相關最富集的通路分析，數(shù)據(jù)顯示NF-κB信號通路在20條最富集的通路中（圖3b）。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)miR- 30d-5p的表達與NF-κB信號通路呈正相關，且RT-qPCR發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p在TNF-Exo中的表達明顯高于PBS-Exo（圖3c）。TNF-α刺激后PMNs中的miR-30d-5p水平下降，這表明miR-30d-5p從細胞室轉移到外泌體（圖3d）。用TNF-Exo體外培養(yǎng)的巨噬細胞顯示出更高水平的miR-30d-5p（圖3e）。這些結果表明，TNF-α可以增強miR-30d-5p在PMN外泌體中的裝載并轉移到受體巨噬細胞中。因此，推測TNF-Exo可能將miR- 30d-5p轉移到巨噬細胞中，進而激活NF-κ b信號通路。

圖3 PMN來源外泌體的miRNA分析

4.   TNF-Exo通過miR-30d-5p激活巨噬細胞NF-κB信號通路

為了驗證上述假設，在與TNF-Exo培養(yǎng)之前，用miR-30d-5p抑制劑轉染Raw264.7巨噬細胞。發(fā)現(xiàn)轉染miR-30d-5p抑制劑可逆轉由TNF-Exo誘導的M1巨噬細胞標記物和促炎細胞因子的上調（圖4a-c）。此外，抑制miR-30d-5p顯著降低了TNF-Exo處理的受體巨噬細胞中NF-κB p-p65蛋白的表達（圖4d）。此外，在用TNF-Exo培養(yǎng)之前，用miR-30d-5p抑制劑處理Raw264.7巨噬細胞可降低NLRP3和caspase-1的mRNA水平（圖4e）。轉染miR-30d-5p抑制劑對TNF-Exo加ATP的caspase-1激活有顯著的抑制作用（圖4f-g）。TNF-Exo+ATP刺激上調的GSDMD n端也被miR-30d-5p抑制劑抑制（圖4h）。這些數(shù)據(jù)表明，外泌體miR-30d-5p通過激活NF-κB信號通路促進M1巨噬細胞活化，啟動巨噬細胞焦亡。

圖4 TNF-Exo通過miR-30d-5p激活巨噬細胞NF-κB信號通路

5.  外泌體miR-30d-5p通過靶向SOCS-1和SIRT1激活巨噬細胞NF-κB

生物信息學分析表明，細胞因子信號抑制因子SOCS-1和sirtuin 1可能是miR-30d-5p的靶基因，也是NF-κB信號通路的負調控因子。通過Targetscan預測的那樣，miR-30d-5p可能保留了SOCS-1和SIRT1的3’-UTR的結合位點（圖5a）。雙熒光素酶報告分析，發(fā)現(xiàn)SOCS-1/SIRT1 3’-UTR WT組中的miR-30d-5p過度表達顯著降低了熒光素酶活性，但3’-UTR Mut組中沒有（圖5b）。在Raw264.7巨噬細胞中，miR-30d-5p過表達抑制了SOCS-1和SIRT1的mRNA和蛋白水平（圖5c-d）。所有這些結果都表明SOCS-1和SIRT1是miR-30d-5p的直接靶基因。為了確定外體miR-30d-5p是否靶向巨噬細胞中的SOCS-1/SIRT1，研究發(fā)現(xiàn)TNF外泌體處理的巨噬細胞中SOCS-1和SIRT1的mRNA和蛋白質表達均降低（圖5e–f），而miR-30d-5p抑制劑逆轉了SOCS-1和SIRT1的表達（圖5g）。研究表明SIRT1通過降低NF-κB p65亞基賴氨酸310的乙?；絹斫档?/span>NF-κB活性。在這個研究中TNF-Exo后p65賴氨酸310乙?；鰪姡▓D5f），而抑制miR-30d-5p后p65賴氨酸310乙?；瘻p弱（圖5g）。這些結果表明，外泌體miR-30d-5p靶向巨噬細胞中的SOCS-1和SIRT1，隨后通過增加p65賴氨酸310的乙?；饔眉せ?/span>NF-κB。

圖5外泌體miR-30d-5p通過靶向SOCS-1和SIRT1激活巨噬細胞NF-κB

6.   抑制miR-30d-5p可減輕TNF Exo或CLP誘導的肺損傷

在體內研究miR-30d-5p在TNF-Exo中的功能作用。發(fā)現(xiàn)注射TNF Exo后，肺組織中的miR-30d-5p表達顯著增加（圖6a）。在注射TNF-Exo之前，通過小鼠尾靜脈給予miR-30d-5p抑制劑或置位陰性對照，并檢測肺組織中促炎細胞因子和NLRP3炎性體的表達水平。結果顯示，在TNF-Exo給藥后，miR-30d-5p抑制劑顯著降低了IL-1β、iNOS、NLRP3、caspase-1mRNA的表達水平（圖6b-c）。此外，抑制miR-30d-5p可降低TNF-Exo誘導的肺中M1巨噬細胞活化和巨噬細胞死亡（圖6d，e）以及組織學損傷（圖6f）。

此外，應用CLP小鼠模型模擬膿毒癥，進一步證實miR-30d-5p在體內的作用。CLP小鼠肺組織中miR-30d-5p的表達也顯著增加（圖6g）。在miR-30d-5p抑制CLP模型中，IL-6、iNOS、NLRP3 mRNA表達下降（圖6h，i），M1巨噬細胞活化和肺內巨噬細胞死亡減少（圖6j，k）以及肺損傷減輕（圖6l）。值得注意的是，miR-30d-5p抑制的CLP小鼠的存活率顯著高于未抑制的CLP小鼠（圖6m）。所有這些數(shù)據(jù)表明，抑制miR-30d-5p可通過抑制M1巨噬細胞活化和巨噬細胞死亡，從而改善TNF-Exo和CLP誘導的肺損傷。

圖6 miR-30d-5p抑制減輕TNF-Exo或CLP誘導的肺損傷

主要結論：

本研究表明，PMNs來源的外泌體miR-30d-5p可以通過增強M1巨噬細胞極化和啟動巨噬細胞焦亡促進肺部炎癥。調節(jié)嗜中性粒細胞和巨噬細胞之間的交互作用，可減輕膿毒癥相關ALI期間的組織炎癥和損傷，突出了其作為膿毒癥相關ARDS治療策略的潛力（圖6n）。