在結(jié)直腸癌中， CircHERC4作為一種新的致癌驅(qū)動因子，通過miR - 5565p /CTBP2/E- cadherin軸促進腫瘤轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）患者死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明，CircRNA在癌癥的起始和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，CircRNAs協(xié)同癌癥轉(zhuǎn)移的潛在分子機制仍不明確。本研究探討CircHERC4在CRC中的作用機制。本文于2021年10月發(fā)表在《Journal of Hematology ＆ Oncology》，IF= 11.059。

本文技術(shù)路線：

主要結(jié)果

1. CircHERC4在CRC中的識別與特征

首先，選擇兩對CRC組織和癌旁組織進行RNAseq，分析CircRNAs的表達譜，發(fā)現(xiàn)CRC組織中20個差異表達的CircRNA (FC≥10，P < 0.05)。為了篩選與轉(zhuǎn)移相關(guān)的CircRNA，作者將這些被篩選的CircRNA中進行siRNA轉(zhuǎn)染到CRC細胞中，并采用Transwell侵襲試驗篩選出具有功能的環(huán)狀RNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHERC4 (has_Circ_0007113) 是CRC中過表達的最顯著的驅(qū)動轉(zhuǎn)移的CircRNA (Fig 1A)。CircBase報道CircHERC4來自HERC4基因，由4-8外顯子(682 bp)頭尾剪接組成。于是作者設(shè)計了一個分歧引物來擴增HERC4剪接形式，并通過Sanger測序證實CircHERC4中存在剪接連接(Fig 1B)。在DLD-1細胞中，Circ HERC4只能在cDNA中擴增，而不能在gDNA中擴增，這排除了由基因組重排引起的可能(Fig 1C)。此外，通過RNase R處理和放線菌素D實驗檢測CircHERC4的穩(wěn)定性。RNase R和放線菌素D處理后，HERC4 mRNA的水平顯著下調(diào)，而CircHERC4 mRNA水平保持不變(Fig 1C，D)。此外，通過核質(zhì)分離后的qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)CircHERC4主要位于細胞質(zhì)中(Fig 1E)。

Fig1 CircHERC4在CRC細胞中的鑒定與表征

2. CircHERC4 mRNA的過表達與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)

為了進一步明確CircHERC4在CRC中的致癌表型，采用qRT-PCR檢測了120對組織樣本中CircHERC4的表達情況。結(jié)果表明，CircHER4表達水平在CRC患者中明顯升高(Fig 2A)。此外，CircHERC4高表達與淋巴轉(zhuǎn)移(Fig 2B)和遠處轉(zhuǎn)移(主要是肝轉(zhuǎn)移)呈正相關(guān)(Fig 2C)。進一步探索CircHERC4的過表達是否由宿主HERC4 mRNA的上調(diào)引起CRC。然而，在120個CRC組織中沒有發(fā)現(xiàn)HERC4 mRNA顯著增加(Fig 2D)。同樣的，HERC4 mRNA與淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移也無相關(guān)性((Fig 2E,F)。因此，作者推測CircHERC4的過表達在CRC中是轉(zhuǎn)錄后被調(diào)控的。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示，CircHERC4高表達的患者總生存期較差(Fig 2G)。HERC4 mRNA表達水平與患者預(yù)后無相關(guān)性(Fig 2H)。綜上所述，這些結(jié)果表明，CircHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)在CRC組織中顯著上調(diào)，而更高的CircHERC4表達可能意味著預(yù)后不良。

Fig 2 CircHERC4在CRC組織中過表達并與轉(zhuǎn)移相關(guān)

3. CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內(nèi)促進CRC的增殖、遷移和侵襲

為了確定CircHERC4的功能作用，作者檢測了CircHERC4在人正常結(jié)腸上皮細胞（HCoEpic）和CRC細胞 (HCT116，DLD-1，HT29，LoVo和SW480) 中的表達。作者發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)腸上皮細胞HCoEpic細胞相比，CircHERC4在CRC細胞中表達明顯上調(diào)，CircHERC4在DLD-1和HCT116細胞中表達相對較高，而在SW480細胞中表達相對較低(Fig 3A)。因此，作者選擇HCT116、DLD-1和SW480細胞進行進一步研究。接下來針對CircHERC4后剪接序列設(shè)計了siRNAs(Fig 3B)。用CircHERC4 siRNA轉(zhuǎn)染DLD-1和HCT116細胞，成功地沉默了CircHERC4 (Fig 3C)。CCK-8實驗顯示，沉默CircHERC4可顯著抑制DLD-1和HCT116細胞的活力(Fig 3D)。此外，集落形成實驗顯示，與陰性對照相比，CircHERC4下調(diào)組的DLD-1和HCT116細胞的增殖能力也受到抑制(Fig 3E)。此外，transwell實驗顯示，沉默CircHERC4可以抑制DLD-1和HCT116細胞的遷移和侵襲能力(Fig 3F)。而成功構(gòu)建過表達CircHERC4質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到SW480細胞中，發(fā)現(xiàn)CircHERC4明顯增加(Fig 3G)，提示CircHERC4上調(diào)可顯著促進體外CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(Fig 3H–J)。

此外，異種移植和轉(zhuǎn)移小鼠模型也支持CircHERC4在體內(nèi)發(fā)揮致癌作用的觀點。在皮下腫瘤模型中，CircHERC4沉默(sh-CircHERC4-1和shCircHERC4-2)和陰性對照(sh-NC) HCT116細胞通過皮下注射到BALB/c裸鼠中。每7天測量腫瘤體積，并讓腫瘤生長35天。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，sh-CircHERC4組的腫瘤生長速度和腫瘤重量明顯受到抑制(Fig 3K–M)。將上述三組HCT116細胞轉(zhuǎn)移到腫瘤小鼠模型中，小鼠生長60天后，處死小鼠，取肺、肝進行HE染色，檢測轉(zhuǎn)移灶的形成。發(fā)現(xiàn)肺和肝臟均有轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)(Fig 3N)。與陰性對照組相比，sh-CircHERC4組肺、肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率顯著降低(Fig 3N)。HE染色進一步顯示sh-NC組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積極高，而sh-CircHERC4組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積顯著降低(Fig 3O)。以上數(shù)據(jù)證實了CircHERC4在體外和體內(nèi)均能促進CRC的進展，特別是轉(zhuǎn)移。

Fig3 CircHERC4作為一種致癌基因，在體外和體內(nèi)調(diào)控增殖、遷移和侵襲

4. CircHERC4直接與CRC細胞中的miR - 5565p結(jié)合

CircHERC4主要位于CRC細胞的細胞質(zhì)中，提示其可能具有轉(zhuǎn)錄后功能。因此，作者通過StarBase和Circinteractome預(yù)測其潛在的結(jié)合miRNA。作者初步篩選出了36miRNAs。為了確定這些miRNA是否能與CircHERC4結(jié)合，通過miRNA模擬物進行了熒光素酶篩選。作者構(gòu)建了一個CircHERC4片段，并將其插入psiCHECK-2質(zhì)粒中熒光素酶報告基因的下游。然后將miRNA模擬物與luc-CircHERC4報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。與對照相比，其中7個miRNAs可以使熒光素酶活性降低至少40%，在雙熒光素酶報告實驗中，miR-556-5p對熒光素酶活性的抑制作用最強 (Fig 4A)。為了證實這一預(yù)測，作者設(shè)計了靶向連接位點的生物素化CircHERC4探針和scrambled oligo probes探針并用于在DLD-1細胞中進行RNA下拉試驗。RNA下拉實驗后的qPCR結(jié)果顯示，CircHERC4 mRNA顯著富集，而宿主HERC4 mRNA則不顯著富集。通過qPCR檢測CircHERC4拉下部分中所有具有熒光素酶活性抑制作用的7個miRNAs。miR-556-5p在CircHERC4下拉部分的富集顯著高于NC組和其他miRNAs (Fig 4B)。這些結(jié)果提示miR-556-5p能直接與CircHERC4結(jié)合，并參與CircHERC4在CRC中的功能。

Fig 4 CircHERC4通過與miR-556-5p相互作用促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲

5. miR -5556- 5p的抑制介導(dǎo)了CircHERC4的致癌功能，并激活了CRC中的Notch信號通路

由于目前尚無關(guān)于miR-556-5p在CRC的研究，作者首先通過qPCR檢測證實了miR-556-5p在臨床CRC樣本中的表達模式。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-556-5p在CRC組織中下調(diào)(Fig 4C)。作者進一步分析了miR-556-5p在有無轉(zhuǎn)移的CRC患者中的表達情況，結(jié)果顯示miR-556-5p在有淋巴轉(zhuǎn)移(Fig 4D)或遠處轉(zhuǎn)移患者中表達水平明顯降低(Fig 4D,E)。為了探究miR-556-5p的功能作用，作者將miR-556-5p模擬物轉(zhuǎn)染到DLD-1和HCT116細胞中。所有結(jié)果顯示，miR-556-5p可顯著抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(Fig 4F-H)。此外，通過挽救實驗在SW480中共轉(zhuǎn)染miR- 556-5p模擬物和CircHERC4過表達載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-556-5p模擬物可以部分恢復(fù)CircHERC4過表達增強SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力(Fig 4I-K)。綜上所述， miR-556-5p具有抗癌作用，并通過直接結(jié)合在CRC中部分介導(dǎo)CircHERC4的致癌功能。

然而，可能受到CircHERC4/miR-556-5p軸的影響的下游信號通路尚不清楚。因此，作者在沉默CircHERC4或過表達miR-556-5p后進行了RNA測序。根據(jù)維恩圖顯示，作者篩選出了9109個在CircHERC4沉默和miR-556-5p過表達的DLD-1細胞中顯著改變的轉(zhuǎn)錄本，KEGG通路富集分析表明，這9109個轉(zhuǎn)錄本富集在許多腫瘤相關(guān)信號通路中，尤其是被廣泛認為是大腸癌發(fā)生激活因子的Notch信號通路(Fig 5B)。作者假設(shè)CircHERC4可能通過激活Notch信號通路促進細胞轉(zhuǎn)移，而Notch信號通路可能被miR-556-5p阻斷。

Fig 5 CTBP2是miR-556-5p的靶基因

6. CTBP2是miR - 5565p的靶點，通過抑制結(jié)直腸癌中E - cadherin的表達發(fā)揮致癌作用

作者進一步探討了miR-556-5p靶向的Notch信號通路的效應(yīng)因子。熱圖顯示，Notch信號通路中的大部分基因通過沉默CircHERC4和過表達miR-556-5p而下調(diào)(Fig 5C)。結(jié)合生物信息學分析，CTBP2被預(yù)測為miR-556-5p的靶點(Fig 5D)。為了進一步證實這一假設(shè)，作者進行了熒光素酶實驗來驗證miR-556-5p和CTBP2之間的相互作用。將含有miR-556-5p野生型和突變型結(jié)合位點的CTBP2 3’UTR片段克隆到熒光素酶報告質(zhì)粒psiCHECK2中，并與miR-556-5p 模擬物或miR-NC模擬物共轉(zhuǎn)染到DLD-1細胞中。結(jié)果表明過表達miR-556-5p顯著降低了包含野生型結(jié)合位點載體的熒光素酶活性，而非包含突變型結(jié)合位點載體的熒光素酶活性(Fig 5D)。此外，作者通過WB實驗證明，miR-556-5p可以顯著抑制CTBP2的蛋白水平，但卻挽救了CTBP2[26]的靶基因E-cadherin的表達（Fig 5E）。

CTBP2被認為是結(jié)直腸癌中腫瘤發(fā)展的一個重要方面。作者分析了GEPIA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CTBP2蛋白在結(jié)直腸癌組織中中位表達水平高于癌旁正常組織(Fig 6A)。 接下來，研究了120例CRC樣本中CTBP2 mRNA的表達，在免疫組化中觀察到了CTBP2在CRC中高表達(Fig 6B)。此外，生存分析評估也發(fā)現(xiàn)了CTBP2高表達與CRC患者較差的生存概率顯著相關(guān)(Fig 6C)。作者構(gòu)建并轉(zhuǎn)染CTBP2 siRNA到DLD-1和HCT116細胞中，通過WB實驗證實E-cadherin蛋白表達水平下降(Fig 6D)。與對照組相比，沉默CTBP2顯著抑制DLD-1和HCT116細胞增殖、遷移和侵襲能力的表達(Fig 6E-G)。這些結(jié)果證明了CTBP2是miR-556-5p的靶基因，其過表達通過抑制E-cadherin介導(dǎo)CRC腫瘤轉(zhuǎn)移。

Fig 6 CTBP2在CRC組織中過表達，可促進CRC細胞的發(fā)展

7. 沉默CTBP2可以消除過表達CircHERC4引起的作用

作者已經(jīng)證實CircHERC4可以阻斷miR-556-5p，于是進一步驗證CircHERC4是否能調(diào)控miR-556-5p靶蛋白CTBP2的表達。轉(zhuǎn)染lv - CircHERC4– shRNA到DLD-1和HCT116細胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CircHERC4基因敲除后，CTBP2蛋白水平顯著降低。相反，CTBP2的下游靶點E-cadherin顯著增加(Fig 6H)。免疫組化染色檢測sh-NC、sh-CircHERC4-1和sh-CircHERC4-2組HCT116細胞中CTBP2、E-cadherin和Ki67的表達。發(fā)現(xiàn)CircHERC4沉默后E-cadherin的表達水平被誘導(dǎo)，Ki-67在急劇下調(diào)(Fig 6i)。為了進一步研究CircHERC4是否通過誘導(dǎo)CTBP2的表達來產(chǎn)生致瘤性，作者進行了一項挽救實驗來研究CircHERC4和CTBP2之間的功能相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與感染空載或siNC模擬物的SW480相比，轉(zhuǎn)染CTBP2 siRNA模擬物的過表達CircHERC4的細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯下降(Fig 6J-I)，提示CircHERC4的致癌功能可以通過消除CTBP2的表達而部分逆轉(zhuǎn)。WB結(jié)果顯示，CTBP2可以部分挽救CircHERC4對E-cadherin表達的影響(Fig 6m)。

此外，根據(jù)CRC樣本的臨床分期，對10個高級別和10個低級別CRC樣本進行FISH檢查，以證實CircHERC4/miR-556-5p/CTBP2軸之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHERC4和CTBP2在高級別CRC組織中過表達，而miR-556-5p在低級別組織中含量較高(Fig 7A）。最后，進行了包含四組體內(nèi)挽救實驗(vector，CircHERC4 OE， CircHERC4 OE + CTBP2 siRNA， CircHERC4 OE + miR-556-5p mimic)。異種皮下移植結(jié)果表明，CircHERC4過表達可加速腫瘤生長，注射CTBP2 siRNA或miR-556-5p mimic后，這種作用可被抑制(Fig 7B-D)。

此外，免疫組化實驗表明， 過表達CircHERC4可上調(diào)CTBP2和Ki67，下調(diào)E-ca的表達;這種效果可以通過抑制CTBP2或miR-556-5p過表達挽救(Fig 7E)。在尾靜脈注射小鼠模型中，上調(diào)的CircHERC4促進了肺和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成，當CTBP2下調(diào)或miR-556-5p上調(diào)時，CircHERC4誘導(dǎo)的致癌作用被阻斷(Fig 7F-G)?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明CTBP2可以促進CRC的進展，并且在體內(nèi)和體外都受到CircHERC4/miR-556-5p軸的調(diào)控。

Fig7 CTBP2受circHERC4/miR-556-5p相互作用的調(diào)控

 
   綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一個之前未被發(fā)現(xiàn)的致癌驅(qū)動因子CircHERC4。CircHERC4在CRC組織中升高，并與CRC的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。此外，CircHERC4在CRC患者中的高表達與轉(zhuǎn)移和較差的生存率呈正相關(guān)。作者提出了CircHERC4可以阻斷miR-556-5p對CTBP2的抑制活性的機制;因此，沉默CircHERC4可以下調(diào)表達CTBP2同時活化E-cadherin(Fig 8)。

Fig 8闡明circHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信號通路促進CRC發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機制

參考文獻：

He, J., et al., Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol, 2021. 14(1): p. 194.