LIFR?NF-κB?LCN2軸控制肝臟腫瘤的發(fā)生和對鐵死亡的易感性

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝細(xì)胞中最常見的實(shí)體腫瘤，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。鐵死亡在癌癥中具有較大的治療潛力。本研究探討高甲基化水平基因LIFr在調(diào)控HCC細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮的作用。本文于2021年12月發(fā)表在《Nature communications》雜志上，IF=12。298。

本研究技術(shù)路線：

本研究主要結(jié)果：

1.   LIFR在HCC中下調(diào)，LIFR的缺失促進(jìn)肝癌的發(fā)生

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)和qPCR分析顯示 ，與正常組織相比，LIFR mRNA水平在HCC中顯著下調(diào) (Fig 1a–c)。接下來作者通過n -亞硝基二乙胺(DEN)誘導(dǎo)小鼠肝臟腫瘤。 5只一歲的DEN處理的C57BL/6小鼠中有4只肝臟腫瘤中Lifr的表達(dá)低于正常小鼠肝臟組織 (Fig 1d)。

為了研究LIFR的功能，在 C57BL/6 菌株通過 LoxP-flanked (floxed)處理獲得 Lifr flox/flox(Lifr fl/fl )純合子。然后，作者通過 albumin-Cr小鼠獲得肝細(xì)胞特異性Lifr缺失突變體(Lifr fl/ fl; Alb-Cre)小鼠。與預(yù)期一樣，Alb-Cre小鼠肝臟中Lifr mRNA和蛋白水平下降 (Fig 1e-f)。為了確定肝臟表型，作者跟蹤了一組小鼠到 2歲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在14只Lifr fl/ flAlb-Cre小鼠中有4只觀察到肉眼可見的肝臟腫瘤(4只小鼠的腫瘤數(shù)量分別為1、2、3和4)，而12只Lifr fl/fl小鼠均未顯示可見腫瘤(Fig 1g)。與此同時，14日齡時，作者對Alb-Cre小鼠腹腔注射DEN。并在7個月后對所有小鼠實(shí)施安樂死，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20只Lifr fl/flAlb-Cre小鼠中檢測到4只存在顯著的HCC腫瘤負(fù)擔(dān)，但在15只Lifr fl/fl對照小鼠中沒有發(fā)現(xiàn) (Fig 1h)。Alb-Cre小鼠從第5個月時開始死于肝臟腫瘤，Lifr fl/fl小鼠從第14個月時開始死于肝臟腫瘤。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Lifr是自發(fā)和致癌誘導(dǎo)的肝臟腫瘤的抑制因子。此外，LifrLifr的缺失顯著加重了癌基因誘導(dǎo)的肝細(xì)胞瘤，并增加了肝臟重量和肝臟體重比(Fig 1j-m)。

為了解成年小鼠中Lifr缺失的影響。枸櫞酸他莫昔芬注射到小鼠中處理5天之后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Lifr fl/fl ;Cre-ERT2小鼠和Lifr fl/fl小鼠肝癌明顯惡化(Fig 1n-q)，表明 LIFR 是成年肝癌基因誘導(dǎo)的抑制因子。

Fig 1 Lifr的缺失會促進(jìn)肝癌的發(fā)生

2.   LIFR對誘導(dǎo)鐵死亡的藥物具有敏感性

為了評估LIFR的表達(dá)是否與藥物反應(yīng)相關(guān)，作者使用了癌癥治療反應(yīng)門戶(CTRP)分析了基因表達(dá)與癌癥細(xì)胞系中481種化合物的反應(yīng)之間的相關(guān)性。來自CTRP的肝癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)顯示LIFR表達(dá)和鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感性密切相關(guān) (Fig 2a)。為了確定LIFR是否能調(diào)節(jié)鐵死亡，作者用鐵死亡誘導(dǎo)物和另外兩種廣泛使用的鐵死亡誘導(dǎo)物RSL3和胱氨酸刺激肝細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種處理都觸發(fā)了對照組PHM細(xì)胞的大量細(xì)胞死亡;相比之下，敲除LIFR的PHM細(xì)胞對誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有抗性(Fig 2b)。相反，過表達(dá)LIFR可使PHM細(xì)胞對所有三種鐵誘導(dǎo)物敏感(Fig 2c)。

最近，相關(guān)研究報(bào)道sorafeni在某些條件下可以觸發(fā)鐵死亡。有趣的是，在sorafeni治療后，細(xì)胞凋亡或壞死抑制劑(而不是凋亡或壞死抑制劑)可以在體外恢復(fù)肝癌細(xì)胞活力。這促使作者研究LIFR是否調(diào)節(jié)索拉非尼的敏感性。對小鼠進(jìn)行為期一周的sorafeni處理后發(fā)現(xiàn)，，索拉非尼治療大大提高了LIFRfl/fl 小鼠存活率(Fig 2d)。索拉非尼治療對LIFRfl/fl 小鼠具有較好的抗腫瘤作用而對LIFRfl/fl Alb-Cre小鼠的作用不明顯(Fig 2e)。

索拉非尼治療后，與LIFRfl/fl Alb-Cre小鼠相比，LIFRfl/fl小鼠中4-HNE 的含量明顯增加(Fig 2 f，g)。索拉非尼治療可使 HCC 腫瘤中4- HNE水平升高(Fig 2j，k) ，而 LIFR 過表達(dá)可使4- HNE水平進(jìn)一步升高，而lipro-1聯(lián)合治療可逆轉(zhuǎn)4-HNE 水平(Fig 2j，k)。這些數(shù)據(jù)表明 LIFR 抑制HCC 的生長并提高對索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性。

Fig 2 LIFR對鐵死亡敏感

3.   LIFR是NF-κB信號通路和LCN2的負(fù)調(diào)控因子

為了確定Lifr丟失對肝臟轉(zhuǎn)錄組的影響，作者對Lifrfl/fl和Lifrfl/fl;Alb-Cre小鼠肝臟組織進(jìn)行了RNA-seq分析。Lcn2是Lifrfl/fl;Alb-Cre小鼠肝臟中上調(diào)倍數(shù)最高的基因之一，已有研究報(bào)道Lcn2促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，其在肝癌中表達(dá)上調(diào)。由于Lcn2具有胞質(zhì)和分泌形式，可以由中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌，于是作者分析了對照細(xì)胞和 LIFR 基因敲除后 PHM 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn) LCN2是 LIFR 喪失后前五位上調(diào)的細(xì)胞因子之一(Fig 3b)。進(jìn)一步通過 qPCR (Fig 3 c)和 ELISA (Fig 3 d)驗(yàn)證了 LCN2在LIFR 敲除 PHM 細(xì)胞中的表達(dá)，以及 LCN2在LIFRfl/fl、 Alb-Cre 小鼠血清中的表達(dá)(Fig 3 e)。LIFR 基因敲除后 PHM 細(xì)胞p65磷酸化水平顯著升高，LIFR 基因重新表達(dá)可逆轉(zhuǎn) p65磷酸化水平(Fig 3f) ，在 LIFR 敲除的肝癌細(xì)胞系 Mahlavu 和 PLC/PRF/5中觀察到同樣的效果(Fig 3g -f)。

與lifr缺失的PHM cell相似(Fig 3f)，lifr敲除的小鼠肝臟中p65磷酸化(Fig 3i, j)以及Lcn2 mRNA(Fig 3k, l)和蛋白水平均上調(diào)(Fig 3m, n)，表明NF-κB信號通路的激活。與此相反， Stat3、 Yap、 Akt 和 Erk 的磷酸化水平并沒有顯著下降(Fig 3i，j)。此外，他莫昔芬誘導(dǎo) LIFR 上調(diào)p65磷酸化，但不影響肝內(nèi) stat3磷酸化(Fig 3o)。Lcn2在LIFR過表達(dá)的PHM細(xì)胞中下調(diào)，在癌基因誘導(dǎo)的HCC模型中，腺病毒介導(dǎo)的LIFR降低了肝組織中p65磷酸化和Lcn2蛋白水平(Fig 3p， q)，并降低了血清中的Lcn2水平。

Fig 3 LIFR負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB信號通路和肝臟LCN2

4 . LIFR的缺失通過SHP1激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致LCN2的上調(diào)

為了了解LIFR如何調(diào)節(jié)NF-κB信號，作者通過一個蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫獲取LIFR潛在的相互作用蛋白。在所有候選基因中，磷酸酶SHP1下調(diào)肝癌細(xì)胞 p65磷酸化已被報(bào)道。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHP1，而非SHP2，被SFB 標(biāo)記的LIFR 蛋白通過 s 蛋白珠拉下來，但是沒有被 SFB標(biāo)記的 GFP 蛋白拉下來(Fig 4 a，b)。SHP1已經(jīng)被證明可以與TRAF6相互作用，并抑制K63-linked的泛素化，導(dǎo)致NF-κB信號通路失活。而E3連接酶TRAF6介導(dǎo)k63連接的泛素化和TAK1的激酶激活，進(jìn)而在NF-κB通路中激活I(lǐng)KK。作者過表達(dá)LIFR降低了 TRAF6的 k63連鎖泛素化和 p65的磷酸化，這可能是SHP1的降低導(dǎo)致的(Fig 4c)，這表明LIFR 通過 SHP1抑制TRAF6的泛素化和 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。LIFR 在人肝癌細(xì)胞系 PLC/PRF/5中的過表達(dá)導(dǎo)致 IKKα/β 磷酸化水平下調(diào)，IκBα 蛋白水平上調(diào)，SHP的降低可消除這些影響(Fig 4d)。此外，LIFR 的降低顯著增加 p65磷酸化，減弱 SHP1和traf6之間的相互作用，而不影響SHP1564位點(diǎn)的磷酸化（SHP1磷酸酶活性的指標(biāo)）(Fig 4e)。這些數(shù)據(jù)表明 LIFR 促進(jìn)SHP1- TRAF6的相互作用，進(jìn)而抑制 TRAF6泛素化和 NF-κB 信號通路。

為探討NF-κB是否介導(dǎo)LIFR缺失的HEK293T、PLC/PRF/5和PHM細(xì)胞株中LCN2的上調(diào)，作者使用shRNA敲除了這3個細(xì)胞系中的p65，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p65的缺失逆轉(zhuǎn)了LCN2誘導(dǎo)的LIFR降低(Fig 4f–h)。肝細(xì)胞特異性敲除LIFR 顯著增加了肝組織中 LCN2的表達(dá)水平，而體內(nèi)敲除 p65或 LCN2可逆轉(zhuǎn)這一過程(Fig 4 i，j)。p65 和LCN2的干擾阻斷了肝細(xì)胞特異性LIFR基因敲除所誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生(Fig 4k-m)，提示LIFR 基因的缺失一定程度上能通過 NF-κB 和 LCN2促進(jìn)肝癌的發(fā)生。

Fig 4 LIFR的缺失通過SHP1激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致LCN2的上調(diào)

5.  LIFR和SHP1對鐵死亡正向調(diào)控，LCN2對鐵死亡負(fù)向調(diào)控
   作者發(fā)現(xiàn)，用鐵死亡誘導(dǎo)劑處理HT1080細(xì)胞一段時間后會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而敲除LIFR或SHP1可以在鐵死亡誘導(dǎo)劑處理5和10小時后保護(hù)HT1080細(xì)胞免受細(xì)胞死亡 (Fig 5a-d)。此外，LIFR 或 SHP1基因敲除可以減少RSL3、 fin56或 fino2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Fig 5e，f)。另一方面，隨著時間的推移，LCN2的下調(diào)使HT1080細(xì)胞敏感，鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，可以通過與鐵死亡抑制劑liproxstatin-或鐵螯合劑 deoxamine (DFO)的聯(lián)合治療來挽救 (Fig 5g)。在用 RSL3，fin56或 fino2處理的ht1080細(xì)胞時觀察到類似的效果(Fig 5h)。敲低LIFR 或 SHP1可降低脂質(zhì)過氧化(Fig 5i，j)，而敲低 LCN2可升高脂質(zhì)過氧化，這中效果能被 liprostatin-1或 DFO 所逆轉(zhuǎn)(Fig  5k)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí) LIFR和 SHP1是鐵死亡的正向調(diào)節(jié)因子，而 LCN2是鐵死亡的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。

Fig 5 LIF和SHP1對鐵死亡正向調(diào)控，LCN2對鐵死亡負(fù)向調(diào)控

6.  LCN2介導(dǎo)鐵死亡耐藥，是提高索拉非尼療效的有效靶點(diǎn) 

作者推測 LIFR 通過下調(diào) LCN2調(diào)節(jié)鐵死亡。實(shí)際上，LIFR過表達(dá)能提高PLC/PRF/5細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑或索拉非尼的敏感度，這種效果可以通過與 liprostatin-1、 DFO 或純化的 LCN2蛋白協(xié)同作用而逆轉(zhuǎn)，這表明 LIFR 能通過LCN2使肝癌細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感。相反，在 Mahlavu 細(xì)胞中敲除LIFR，以及在PHM 細(xì)胞中敲除 LIFR，則上調(diào)LCN2導(dǎo)致的對鐵死亡誘導(dǎo)劑和索拉非尼耐藥性，而這種耐藥性可以通過敲低LCN2而逆轉(zhuǎn)(Fig 6 a,b)。

肝臟中LIFR缺失會引起鐵(Fe2 +)水平下調(diào)(Fig 6c)。作者假設(shè) lcn2的缺失是通過提高細(xì)胞中 Fe2 + 和脂質(zhì)過氧化的水平來增加對鐵死亡的敏感性。LIFR的缺失降低了細(xì)胞內(nèi) Fe2 + 水平和脂質(zhì)過氧化水平，而 lcn2的敲除可以逆轉(zhuǎn)這兩種效應(yīng)(Fig 6d,e)。另一方面，LIFR或 lcn2的缺失并沒有改變谷胱甘肽(GSH)、 Slc7a11、 fsp1和 gpx4的水平(Fig 6f，g)。作者測量了LIFR敲除的PHM小鼠肝細(xì)胞系中鐵的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIFR的缺失降低了細(xì)胞中Fe2+和脂質(zhì)過氧化的水平(Fig 6 d,e)。另一方面，LIFR或Lcn2的缺失并沒有改變谷胱甘肽(GSH)，Slc7a11， Fsp1和Gpx4的水平 (Fig 6f,g)。

為了進(jìn)一步探索LCN2靶向制劑是否能提高索拉非尼的治療效果，作者在 NSG小鼠中建立了4個 HCC 異種移植(PDX)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個 PDX 株系(# 3-# 6)中有三個表現(xiàn)為 LIFR低表達(dá)，同時 LCN2和磷酸化 p65水平較高(Fig 6h)。在所有品系中，其中# 5株系LIFR 水平最低，lcn2水平最高，# 4株系則相反(Fig 6h)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，將#4和# 5 PDX中的PDX腫瘤組織植入NSG小鼠，當(dāng)腫瘤達(dá)到50 – 100 mm3時開始治療。將小鼠分為4個治療組:(1)IgG + vehicle;(2) LCN2抗體+ vehicle;(3) IgG +索拉非尼;(4) LCN2抗體+索拉非尼。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LCN2抗體+ vehicle以及LCN2抗體+索拉非尼組LCN2水平明顯降低(Fig 6i)。無論是否與索拉非尼聯(lián)合治療，PDX # 4的小鼠中，LCN2聯(lián)合抗體治療不改變腫瘤的生長(Fig 6j，l)。在PDX # 5的小鼠中，單獨(dú)使用LCN2聯(lián)合抗體治療對腫瘤生長的影響不大，而聯(lián)合治療比單獨(dú)使用索拉非尼治療具有更好的抗腫瘤效果(Fig 6k，l)?？筁CN2治療并不影響增殖Ki-67和凋亡標(biāo)記物caspase3的水平，而與索拉非尼聯(lián)合治療提高了4-HNE和 MDA（脂質(zhì)過氧化的兩個標(biāo)記物）的水平(Fig 7a，b)。此外，電鏡分析顯示，在 PDX # 5，聯(lián)合治療組的腫瘤細(xì)胞中含有萎縮的線粒體和嚴(yán)重濃縮的膜，這是鐵死亡典型的形態(tài)學(xué)特征。索拉非尼或LCN2抗體單獨(dú)治療也能增加線粒體膜密度，但程度要小于它們聯(lián)合治療(Fig 7c)。在 PDX # 4中，無論是單獨(dú)使用索拉非尼治療還是聯(lián)合治療都能誘導(dǎo)磷酸化鐵蛋白相關(guān)的線粒體形態(tài)改變，而抗lcn2治療并不能改變線粒體形態(tài)(Fig 7d)?？傊?，一種中和LCN2的抗體增強(qiáng)了索拉非尼對低LIFR表達(dá)和高LCN2表達(dá)的肝癌患者來源的異種移植瘤的鐵誘導(dǎo)作用。

Fig 6 LCN2介導(dǎo)鐵死亡耐藥，是提高索拉非尼療效的治療靶點(diǎn)

Fig7一種中和LCN2的抗體增強(qiáng)了索拉非尼對低LIFR表達(dá)和高LCN2表達(dá)的肝癌患者來源的異種移植瘤的鐵誘導(dǎo)作用。

LIFR 的缺失通過 SHP1 激活NF-κB 信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致鐵螯合細(xì)胞因子 LCN2 的上調(diào)，導(dǎo)致對對鐵死亡誘導(dǎo)劑不敏感。因此抗 LCN2 療法可以通過靶向鐵死亡來改善肝癌治療。

 
參考文獻(xiàn)：

[1] Yao Fan，Deng Yalan，Zhao Yang et al。 A targetable LIFR-NF-κB-LCN2 axis controls liver tumorigenesis and vulnerability to ferroptosis。[J] 。Nat Commun， 2021， 12: 7333。