淺談DUSP26誘導(dǎo)主動(dòng)脈瓣鈣化的機(jī)制

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(CAVD)的發(fā)病率和死亡率仍然很高，而治療選擇有限。在此，作者評(píng)估了雙特異性磷酸酶26 (DUSP26)在CAVD中的作用和治療價(jià)值。本研究于2021年6月發(fā)表在《European Heart Journal》IF：29.983期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、由于m6 A修飾，DUSP26在人鈣化主動(dòng)脈瓣中上調(diào)

為了鑒定參與CAVD的基因，對(duì)人鈣化性主動(dòng)脈瓣（CAV）進(jìn)行測序，獲得差異表達(dá)基因譜（圖1A）。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，檢測在CAV組最顯著上調(diào)的10個(gè)差異表達(dá)基因在50對(duì)樣本中的表達(dá)，有8個(gè)和測序結(jié)果的趨勢一致，用shRNA干擾他們的表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)DUSP26對(duì)成骨標(biāo)志基因的下調(diào)最顯著，所以作者將DUSP26用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。圖1B-1D展示了DUSP26的表達(dá)，和成骨標(biāo)志基因的表達(dá)。

為了評(píng)估m(xù)6A和DUSP26上調(diào)的相關(guān)性，作者分析了DUSP26序列，并在其接近終止密碼子的3’-UTR處鑒定到一個(gè)METTL3保守序列（AGACU）（圖1E-1F）。成骨刺激增加了原發(fā)性hVIC中m6A的整體水平，該作用分別被METTL3的沉默或過表達(dá)所減弱和加重（圖1G）。RIP-qRT-PCR（圖1H）和熒光素酶（圖1I）證實(shí)了METTL3和DUSP26之間的相互作用。敲除METTL3顯著降低了DUSP26蛋白的表達(dá)和半衰期，過表達(dá)則相反（圖1J-1M）。這些結(jié)果表明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾是CAVD中DUSP26表達(dá)增加的原因通過增加其穩(wěn)定性。

METTL3通常以YTHDF1依賴的方式介導(dǎo)m4A修飾，所以探究了YTHDF1的作用。結(jié)果顯示敲除YTHDF1顯著降低了DUSP26的蛋白表達(dá)和半衰期，過表達(dá)則相反（圖1N-1O）。YTHDF1和DUSP26的mRNA序列之間結(jié)合，這種結(jié)合作用可以被METTL3沉默和過表達(dá)所抑制或加強(qiáng)（圖1P-1Q）。

圖1 DUSP26在人鈣化主動(dòng)脈瓣中上調(diào)，并經(jīng)歷METT3介導(dǎo)的m6A修飾

2、DUSP26敲除改善體內(nèi)主動(dòng)脈瓣鈣化

為了探究DUSP26在體內(nèi)主動(dòng)脈瓣鈣化中的作用，作者在ApoE-/-小鼠中敲除DUSP26（AAV2-sh-DUSP26組；AAV2-scr為對(duì)照），24周后，HCD t AAV2-scr組最大跨瓣噴射速度和平均跨瓣壓力梯度顯著升高，主動(dòng)脈瓣面積明顯減少；DUSP26的敲除可以部分回復(fù)這些變化（圖2A-2C）。然后檢測了ApoE-/-小鼠瓣葉的形態(tài)、纖維化和鈣化。HCD促進(jìn)主動(dòng)脈瓣鈣化，表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣瓣葉厚度增加、膠原增加、鈣離子沉積（圖2D-2G）。而敲除DSP26可以部分恢復(fù)上述改變，并降低成骨標(biāo)志物的表達(dá)。

圖2 DUSP26缺失可減輕體內(nèi)主動(dòng)脈瓣鈣化

3、DUSP26敲除改善體外主動(dòng)脈瓣鈣化

作者從人主動(dòng)脈瓣分離得到hVICs細(xì)胞用于體外實(shí)驗(yàn)。用成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)hVICs的成骨分化，發(fā)現(xiàn)DSP26的表達(dá)隨著分化時(shí)間逐漸增加（圖3A-3B）。隨后敲除hVICs中的DUSP26，發(fā)現(xiàn)抑制了成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)，以及鈣化結(jié)節(jié)形成和鈣沉積，過表達(dá)DUSP26的效果則相反（圖3C-3D）。這些說明DUSP26沉默在體外也可改善主動(dòng)脈瓣鈣化。

圖3 DUSP26促進(jìn)hVICs的成骨分化

4、在hVICs中，DUSP26和DPP4相互作用并抑制其降解

首先分離hVICs提取物并進(jìn)行DUSP26抗體的免疫沉淀，進(jìn)行MS分析，由此鑒定到DPP4是DUSP26的潛在結(jié)合蛋白（圖4A-4B）。Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者間的結(jié)合關(guān)系（圖4C-4D）。DUSP26是一個(gè)蛋白磷酸酶，于是探究其酶活性是否是兩者結(jié)合所必須的。用F1063-0967處理或突變C152S抑制DUSP26的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不影響兩者間的結(jié)合（圖4E-4F）。因此，DUSP26與DPP4相互作用不依賴于其磷酸酶活性。隨后構(gòu)建兩個(gè)DPP4的截?cái)嘈酝蛔凅w，發(fā)現(xiàn)只有C端突變體可以和DUSP26結(jié)合（圖4G-4H）。以上說明DUSP26和DPP4的C端結(jié)合。

隨后探究DUSP26對(duì)DPP4的表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)敲除DUSP26后DPP4的蛋白表達(dá)顯著下降，過表達(dá)則相反，但都不影響mRNA的表達(dá)（圖4I-4J）。DUSP26沉默誘導(dǎo)的DPP4下調(diào)被26S蛋白酶體抑制劑MG132減弱（圖4K）。此外，DUSP26基因敲除縮短了hVIC中DPP4的半衰期，增加了DPP4的泛素化（圖4L-4M）。

圖4 DUSP26與DPP4相互作用，保護(hù)DPP4在hVICs中免受泛素介導(dǎo)的降解

5、DUSP26抑制hVICs中MDM2介導(dǎo)的DPP4的泛素化

作者在DPP4蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的MDM2結(jié)合基序（圖5A）。為了探究MDM2是否作為DPP4的新型E3連接酶，通過co-IP來評(píng)估DPP4和MDM2之間的相互作用。在hVIC中異位表達(dá)的HA-DPP4與myc標(biāo)記的MDM2共沉淀（圖5B）。內(nèi)源性DPP4和MDM2之間的相互作用也證實(shí)了（圖5C）。此外，MDM2沉默后增加了DPP4的蛋白水平但對(duì)mRNA沒影響（圖5D）。相反，MDM2過表達(dá)降低了hVIC中DPP4的蛋白水平，這種作用受到MG132的抑制（圖5E）。此外，MDM2過表達(dá)降低了hVIC中DPP4的半衰期(圖5F)，并增加了DPP4多聚泛素化(圖5G)。這些數(shù)據(jù)表明DPP4確實(shí)是MDM2的底物。為了確定DPP4與MDM2結(jié)合的區(qū)域，進(jìn)行了體外co-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DPP4的C端與MDM2相互作用（圖5H），之前的結(jié)果中，DUSP26也和DPP4的C端作用，所以探索了DUSP26在hVIC中與MDM2結(jié)合DPP4競爭的能力。hVIC中DUSP26的沉默增強(qiáng)了MDM2和DPP4之間的相互作用（圖5I）。相反，DUSP26過表達(dá)阻斷了MDM2與DPP4的結(jié)合（圖5J）。此外，DUSP26敲除降低了DPP4蛋白水平，在hVIC中，這種效應(yīng)在DUSP26和MDM2共同敲低后減弱（圖5K）。這些結(jié)果說明MDM2作為DPP4的新型E3連接酶，DUSP26與MDM2結(jié)合在DPP4的C端，從而提高DPP4蛋白在hVIC中的穩(wěn)定性。

圖5 DUSP26通過在hVIC中與MDM2介導(dǎo)的泛素化競爭來穩(wěn)定DPP4

6、DPP4過表達(dá)挽救了hVIC中DUSP26沉默誘導(dǎo)的成骨分化表型

接下來，進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)來確定DUSP26是否通過DPP4的上調(diào)來發(fā)揮作用。DUSP26敲低的鈣化減緩作用被DPP4過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)（圖6A和6B）。相反，DUSP26過表達(dá)的促鈣化作用被DPP4過表達(dá)所阻止（圖6C和6D），表明DUSP26通過上調(diào)DPP4在hVICs中促進(jìn)成骨分化。

圖6 DPP4過表達(dá)挽救了hVIC中DUSP26沉默誘導(dǎo)的成骨分化表型

參考文獻(xiàn)：

Wang Yongjun., Han Dong., Zhou Tingwen., Chen Cheng., Cao Hong., Zhang Joe Z., Ma Ning., Liu Chun., Song Moshi., Shi Jiawei., Jin Xin., Cao Feng., Dong Nianguo.(2021). DUSP26 induces aortic valve calcification by antagonizing MDM2-mediated ubiquitination of DPP4 in human valvular interstitial cells. Eur Heart J, undefined(undefined), undefined. doi:10.1093/eurheartj/ehab316