ENSA拷貝數(shù)擴(kuò)增通過調(diào)控膽固醇生物合成促進(jìn)三陰性乳腺癌的進(jìn)展

三陰性乳腺癌(TNBC)約占所有乳腺癌病例的10-20%。其特點(diǎn)是雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達(dá)陰性，HER2無過表達(dá)(也可定義為ERBB2無擴(kuò)增)。與其他形式的乳腺癌相比，TNBC具有更強(qiáng)的侵襲性臨床特征，包括起病年齡更小、腫瘤體積更大、腫瘤分級更高、轉(zhuǎn)移潛力更顯著。TNBC患者遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)和5年內(nèi)死亡的風(fēng)險增加。作為癌癥的一個標(biāo)志，拷貝數(shù)變化（CNAs）在癌癥中無處不在。本研究中，作者探索TNBC中新的受CNAs影響的基因。本文于2022年1月發(fā)表于《Natural communication》，IF=12。121。

本文技術(shù)路線：

本文主要結(jié)果：

1、整合DNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄組分析顯示TNBC中1q21。3區(qū)域的ENSA擴(kuò)增

為了確定TNBC中CNAs驅(qū)動的基因表達(dá)異常，首先根據(jù)TNBC隊列的CNA數(shù)據(jù)和RNA-seq數(shù)據(jù)篩查CNA影響的癌基因。共發(fā)現(xiàn)41個基因，其中，ENSA和GOLPH3L是TNBC中最常見的擴(kuò)增基因(18.5%的患者擴(kuò)增，57.6%的患者拷貝數(shù)增加)，位于1q21.3區(qū)域（Figure 1a）。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，約11%的乳腺癌患者中也發(fā)現(xiàn)1q21.3片段擴(kuò)增(Figure 1b)，并且無病生存期和疾病特異性生存期更差(Figure 1c)。作者進(jìn)一步研究了TCGA隊列中不同亞型乳腺癌1q21.3改變的差異。發(fā)現(xiàn)TNBC(27.7%)及其亞型(32。6%)擴(kuò)增較高(Figure 1d)。為了在感興趣的1q21.3位點(diǎn)中識別潛在的腫瘤促進(jìn)基因，作者在the Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)ENSA的表達(dá)升高，ENSA的高表達(dá)與TNBC患者的無復(fù)發(fā)生存率低有關(guān)(Fig 1e，f)。此外，ENSA在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織，在TNBC中隨著基因擴(kuò)增而增加(Fig 1g，h)。這些結(jié)果表明，ENSA在1q21.3區(qū)域擴(kuò)增，在TNBC中具有臨床預(yù)后價值。

Fig1 ENSA在1.21.3區(qū)域擴(kuò)增，呈高表達(dá)，預(yù)示TNBC生存率較低

2、ENSA促進(jìn)TNBC細(xì)胞的生長

為了確定ENSA在TNBC中的作用，作者用shRNA敲除了ENSA的表達(dá)，并在ENSA表達(dá)相對較高的兩種TNBC細(xì)胞系BT549和MDA-MB-231中恢復(fù)了ENSA最常見的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)(Fig 2a)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENSA下調(diào)對TNBC細(xì)胞生長和集落形成有明顯的抑制作用(Fig 2b， c)。此外，過表達(dá)ENSA在TNBC細(xì)胞中減弱了ENSA沉默對細(xì)胞生長和菌落形成的抑制作用(Fig 2d，e)。ENSA下調(diào)也明顯引起TNBC細(xì)胞的凋亡，但對細(xì)胞周期進(jìn)程幾乎沒有影響(Fig 2f)。這些結(jié)果表明ENSA在促進(jìn)TNBC細(xì)胞生長方面具有重要作用。

Fig2 ENSA是TNBC細(xì)胞生長的主要驅(qū)動力

3、ENSA在TNBC中膽固醇的生物合成中起關(guān)鍵作用

為了探討ENSA的分子機(jī)制，作者對ENSA敲除細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序分析?；蚣患治?/span>(GSEA)顯示，在ENSA沉默的細(xì)胞中，膽固醇通路是最富集的下調(diào)通路(Fig 3a，b)。此外，GSEA顯示ENSA沉默的細(xì)胞凋亡通路上調(diào)，與ENSA缺失誘導(dǎo)的促凋亡表型一致(Fig 3c)。作者利用基因組變異分析進(jìn)一步探討了ENSA表達(dá)TNBC隊列中膽固醇生物合成通路活性之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)ENSA mRNA表達(dá)與TNBC中膽固醇生物合成程序之間存在顯著的正相關(guān)(Fig 3d)。在表達(dá)ENSA shRNA的TNBC細(xì)胞中檢測mRNA和蛋白水平，進(jìn)一步驗證了膽固醇生物合成酶SREBP2(一種優(yōu)先激活膽固醇生物合成基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子)表達(dá)的降低(Fig 3e，f)。重要的是，SREBP2的完整形式和切割形式的蛋白水平都降低了，這與ENSA沉默后SREBP2 mRNA水平的降低是一致的(Fig 3f)。為了確定膽固醇生物合成途徑的主要產(chǎn)物是否發(fā)生了變化，作者采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測膽固醇及其中間代謝物的含量。與膽固醇生物合成相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)相一致，ENSA沉默后，TNBC細(xì)胞中總膽固醇濃度降低(Fig 3g，h)。此外，ENSA敲除后，TNBC細(xì)胞中游離膽固醇含量顯著降低(Fig 3i)。接下來，作者研究了ENSA敲除誘導(dǎo)的表型是否與膽固醇消耗有關(guān)。發(fā)現(xiàn)ENSA敲除的TNBC細(xì)胞中，添加膽固醇可部分抑制ENSA缺失細(xì)胞的生長，增加細(xì)胞凋亡(Fig 3j)?？傊@些發(fā)現(xiàn)支持ENSA可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇生物合成促進(jìn)TNBC細(xì)胞生長的觀點(diǎn)。

Fig 3 ENSA在TNBC中膽固醇的生物合成中起關(guān)鍵作用

4、激活的STAT3參與ENSA誘導(dǎo)的腫瘤生長

為了闡明ENSA消耗誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞表型的分子機(jī)制，作者對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子(TF)分析并假設(shè)STAT3是調(diào)控下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（Fig 4A）。在TNBC細(xì)胞中，p-STAT3 (Tyr705)，而不是p-STAT3(Ser727)或總STAT3，在ENSA敲除后顯著降低(Fig 4b)。ENSA過表達(dá)恢復(fù)了p-STAT3 (Tyr705)的表達(dá)(Fig 4c)。接下來，作者通過在ENSA沉默的TNBC細(xì)胞中過表達(dá)STAT3，證實了STAT3參與ENSA敲除誘導(dǎo)的生長抑制(Fig 4b)。ENSA過表達(dá)恢復(fù)p-STAT3 (Tyr705)水平(Fig 4c)。接下來，作者通過在ENSA沉默的TNBC細(xì)胞中過表達(dá)STAT3來誘導(dǎo)STAT3的組成性激活/磷酸化，證實了STAT3參與ENSA敲除誘導(dǎo)的生長抑制。作者的結(jié)果表明，過表達(dá)STAT3可以部分減弱ENSA缺失引起的TNBC細(xì)胞生長抑制(Fig 4d,e)。在小鼠乳腺脂肪墊異種移植瘤中，ENSA敲除可顯著降低MDAMB- 231細(xì)胞的腫瘤生長，ENSA過表達(dá)可完全挽救MDAMB- 231細(xì)胞的腫瘤生長，而STAT3過表達(dá)可挽救MDAMB- 231細(xì)胞的腫瘤生長(Fig 4f，g)。在免疫組織中，ENSA沉默后，染色p-STAT3 (Tyr705)顯著降低。然而，在ENSA敲除的TNBC腫瘤中，ENSA或STAT3過表達(dá)均增加p-STAT3 (Tyr705)染色(Fig 4h)。根據(jù)體外ENSA缺失誘導(dǎo)的促凋亡表型，在各組異種移植體中cleaved caspase 3的IHC染色表現(xiàn)出相應(yīng)的變化(Fig 4h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ENSA-STAT3信號在促進(jìn)三陰性腫瘤生長中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Fig 4 ENSA通過激活STAT3促進(jìn)腫瘤生長

5、ENSA激活STAT3來調(diào)節(jié)膽固醇的生物合成

接下來，探討激活STAT3是否參與了ENSA誘導(dǎo)的膽固醇生物合成途徑的改變。JASPAR數(shù)據(jù)庫的預(yù)測顯示，STAT3可能與SREBP2的啟動子結(jié)合(Fig 5a)。在 Chip實驗中，作者證實STAT3在SREBP2的啟動子區(qū)域存在一個結(jié)合位點(diǎn)(Fig 5b)。此外，在TNBC細(xì)胞中沉默STAT3可以抑制SREBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)(Fig 5c)。這些結(jié)果表明，在TNBC細(xì)胞中，STAT3可以與SREBP2的啟動子結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄水平上改變SREBP2的表達(dá)(Fig 5b)。此外，在TNBC細(xì)胞中沉默STAT3可以抑制SREBP2 mRNA和蛋白的表達(dá)(Fig 5c)。這些結(jié)果表明，STAT3可以與SREBP2的啟動子結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄水平上改變SREBP2的表達(dá)。作者接下來驗證了啟動子的活性，基于熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)SREBP2被ENSA耗盡所抑制，隨著STAT3過表達(dá)被拯救(Fig 5d)。當(dāng)ENSA敲低時，SREBP2和參與膽固醇生物合成的酶的表達(dá)水平持續(xù)下降，但這種效應(yīng)被STAT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)(Fig 5e)。此外，ENSA耗盡后細(xì)胞游離膽固醇水平降低，STAT3過表達(dá)也可使其恢復(fù)(Fig 5f )。

作者下一步探究ENSA敲除對p-STAT3的抑制作用是否依賴于蛋白磷酸酶2A (PP2A)，PP2A是一種已知的蛋白磷酸酶，其功能被ENSA直接作用所抑制。作者在MDAMB-231細(xì)胞中利用PP2A的靶向siPPP2CA亞基催化PP2A沉默，促進(jìn)p-STAT3 (Tyr705)表達(dá)增加(Fig 5g)。然而，p-STAT3 (Ser727)不受PP2A沉默的影響。此外，ENSA缺失對p-STAT3 (Tyr705)和SREBP2表達(dá)的抑制作用被TNBC細(xì)胞中PP2A的進(jìn)一步下調(diào)所削弱(Fig。 5h)。這些提示ENSA可能以PP2A依賴的方式促進(jìn)STAT3磷酸化調(diào)控TNBC細(xì)胞膽固醇合成。

Fig5 ENSA激活STAT3以pp2a依賴的方式促進(jìn)SREBP2的轉(zhuǎn)錄

6、ENSA決定對STAT3抑制劑的治療敏感性

由于ENSA調(diào)節(jié)STAT3的活性，作者試圖評估ENSA是否可以作為TNBC細(xì)胞中STAT3抑制劑敏感性的治療標(biāo)志物。作者使用STAT3作為STAT3激活的小分子抑制劑。與ENSA敲除組相比，ENSA水平較高的對照組對抑制劑更敏感，且在抑制劑處理后，增長顯著下降(Fig 6a，b)。在3例ENSA表達(dá)水平不同的TNBC患者的類器官中，作者也發(fā)現(xiàn)類器官對抑制劑的敏感性隨著ENSA表達(dá)水平的增加而增加(Fig 6c-e)。此外，在異種移植模型中，當(dāng)ENSA耗盡時，發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞對抑制劑的敏感性顯著降低(Fig 6f，g)。為了進(jìn)一步探討TNBC患者對藥物的反應(yīng)，作者構(gòu)建了7個患者來源的小異種移植(mini-PDX)模型，并測量了歸一化的抑制劑對治療的反應(yīng)(Fig 6h)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ENSA高表達(dá)的腫瘤的敏感性高于ENSA相對低表達(dá)的腫瘤(Fig 6i，j)?？傊?，作者的TNBC細(xì)胞系、類器官、動物模型和mini-PDX模型的結(jié)果都表明，ENSA表達(dá)可以作為STAT3抑制劑有效治療的生物標(biāo)志物。

Fig6 ENSA與TNBC中的Stattic抑制劑敏感性有關(guān)

7、ENSA、p-STAT3和SREBP2在臨床樣本和患者預(yù)后中的表達(dá)相關(guān)性

為了探討作者研究結(jié)果的臨床相關(guān)性，作者首先用免疫組化法檢測了8對TNBC原發(fā)標(biāo)本和相鄰正常組織中ENSA蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TNBC標(biāo)本中ENSA蛋白水平明顯高于正常組織(Fig 7a，b)。為了探討ENSA蛋白表達(dá)與患者生存的相關(guān)性，作者收集138例TNBC患者的手術(shù)標(biāo)本，通過免疫組化分析檢測ENSA蛋白表達(dá)水平(Fig 7c)。樣本Kaplan-Meier分析顯示，ENSA水平高的腫瘤患者的無復(fù)發(fā)生存期和總生存期往往比ENSA水平低的患者更差(Fig 7d)。作者進(jìn)一步檢測了SREBP2、HMGCR和p-STAT3(Tyr705)的蛋白表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示ENSA表達(dá)與SREBP2， HMGCR，p-STAT3 (Tyr705)呈正相關(guān)(Fig 7f)。總之，這些結(jié)果表明ENSA的表達(dá)與下游分子的表達(dá)呈正相關(guān)，在TNBC中是一個不良預(yù)后因素。

Fig7 ENSA、SREBP2、pSTAT3-Tyr705與臨床樣本生存率的相關(guān)性

本研究表明ENSA，是一個通過促進(jìn)TNBC中膽固醇生物合成來觸發(fā)腫瘤生長的基因。ENSA-PP2A-STAT3-SREBP2調(diào)控軸表征了其潛在機(jī)理。作者認(rèn)為STAT3抑制劑Stattic可能是治療ENSA表達(dá)的TNBC的重要方法。

 參考文獻(xiàn)：

Chen， Y.Y.， et al.， Copy number amplification of ENSA promotes the progression of triple-negative breast cancer via cholesterol biosynthesis. Nat Commun， 2022. 13(1): p. 791.