ACSL4缺乏癥對鐵死亡介導的急性腎損傷具有保護作用

2012年首次發(fā)現(xiàn)鐵死亡會導致急性腎損傷(AKI)。但其在AKI中的作用機制尚不清楚。通過對AKI小鼠和正常小鼠腎臟的RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)?；?/span>-輔酶a合成酶長鏈家族(ACSL4)差異表達，本研究探討ACSL4在AKI中的作用。本文于是2022年2月發(fā)表于《Redox Biology》，IF=9.986。

本文技術路線：

本研究主要內(nèi)容：

1、ACSL4在AKI腎組織中高表達

RNA-seq測序結(jié)果顯示，在I/ R誘導小鼠AKI的腎組織中，在鐵死亡相關的幾條關鍵通路，如谷胱肽過氧化物酶4 (GPX4)、鐵抑制蛋白1 (FSP1)、ACSL4通道等，只有ACSL4表達上調(diào)（Fig 1A)。Q-PCR、WB、免疫組化檢測ACSL4表達水平。發(fā)現(xiàn)ACSL4 mRNA和蛋白質(zhì)水平在I/R和fa誘導的AKI小鼠腎組織中均上調(diào)(Fig. 1B–E)。此外，在FA-AKI和I/R-AKI小鼠中，ACSL4 mRNA水平與BUN和CRE呈顯著正相關(Fig. 1F，G)。因此，ACSL4在AKI中呈高表達，并與AKI嚴重程度呈正相關。

Fig1  AKI患者ACSL4表達上調(diào)

2、HIF-1α結(jié)合ACSL4啟動子，負向調(diào)控ACSL4

分析RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示HIF-1信號通路富集(Fig. 2A)。HIF-1信號在AKI中被廣泛報道。此外，HIF-1α激動劑可抑制AKI。WB和RT-PCR結(jié)果顯示，AKI中HIF-1α和HIF-2α表達下調(diào)，ACSL4表達上調(diào)(Fig. 2B)。然后用低氧(1% O2)誘導HIF表達，探討其對ACSL4的影響。缺氧可上調(diào)HIF-1α和HIF-2α的蛋白和mRNA水平而下調(diào)ACSL4的水平(Fig. 2C,D)。此外，shHIF-1α/2α伴侶蛋白ARNT的mRNA水平未被shHIF-1α/2α敲除，而略有升高，可能是代償性升高。然而，敲低HIF-1α能顯著上調(diào)ACSL4的表達水平(Fig 2E. F)。同樣的，HIF-1α抑制劑BAY 87-2243-a上調(diào)ACSL4 mRNA水平。然而，HIF-2α抑制劑PT2385并沒有上調(diào)ACSL4的mRNA水平(Fig. 2G)。此外，敲低HIF-1α可上調(diào)HK-2細胞對鐵死亡的敏感性，而抑制ACSL4可逆轉(zhuǎn)其作用(Fig 2H)。HIF-1α基因敲除后，CCL2的mRNA水平升高(Fig. 2I)。用染色質(zhì)免疫沉淀法探討HIF-1α的調(diào)控機制。首先將HIF-1α過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HK-2細胞。熒光素酶實驗表明HIF-1α抑制ACSL4的表達(Fig. 2J)。然后，在21%或1% O2條件下分離HK-2細胞的細胞質(zhì)和細胞核。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和ACSL4分別在細胞核和細胞質(zhì)中表達(Fig. 2K)。最后，Chip實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以結(jié)合ACSL4的啟動子并干擾ACSL4的表達(Fig. 2L)。綜上所述，HIF-1α可以結(jié)合ACSL4啟動子，對ACSL4進行負向調(diào)控。AKI中下調(diào)HIF-1α可導致AKI中ACSL4的高表達，從而誘發(fā)鐵死亡。

Fig.2  HIF-1α結(jié)合ACSL4啟動子，負向調(diào)控ACSL4

3、在I/ r誘導的AKI中，敲除ACSL4可保護腎臟

建立ACSL4腎小管條件敲除小鼠，研究ACSL4在AKI中的作用。ACSL4基因敲除效果得到證實，結(jié)果顯示，與ACSL4F/F小鼠相比，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟組織中ACSL4蛋白及mRNA表達水平顯著下調(diào)(Fig. 3A and B)。然后，在ACSL4F/F和Cdh16Cre-ACSL4F / F老鼠用I/ r誘導AKI。免疫熒光染色、免疫組化染色和PCR結(jié)果顯示，ACSL4在cdh16crea - acsl4f /F小鼠腎臟中的表達水平下調(diào)，尤其是在腎小管上皮細胞中，因為ACSL4與腎小管上皮標志物細胞角蛋白18 (CK18)共定位(Fig. 3C-E)。Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠的GPX4和Ptgs2 mRNA表達水平分別上調(diào)和下調(diào)(Fig. 3E)。GPX4是一種重要的抗氧化過氧化物酶，它的失活直接導致鐵死亡。而Ptgs2也是一種已知的鐵死亡增加標記物。因此，這些結(jié)果證實了Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠對鐵死亡的抑制作用。此外，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低(Fig. 3F) 。BUN和CRE含量均顯著降(Fig. 3G)。此外，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟的病理損傷減輕(Fig. 3H)， TUNEL染色的 (Fig.3I)表明ACSL4敲除對I/ r誘導的AKI具有保護作用。因此，在腎小管中敲除ACSL4可以通過靶向鐵死亡來抑制I/ r誘導的AKI。

Fig. 3  敲除腎ACSL4對AKI有保護作用

4. Cdh16cre - ACSL4F/F抑制I/ r誘導AKI的炎癥反應

炎癥也被認為是AKI的關鍵因素。鐵死亡是一種促炎因子，招募巨噬細胞，引起AKI的炎癥。RNA序列分析顯示，在ACSL4F / F I / R組基因水平顯著改變。相比之下，Cdh16Cre-ACSL4F/F組基因水平是正常的(Fig.4A). Cdh16Cre-ACSL4F/F降低了高水平的炎癥因子，包括Mmp8, Hmox1, Lcn2，Cxcl2、Cxcl1、Stat3、Cxcl3、IL-6 (Fig. 4B)。RT-PCR結(jié)果顯示，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠的腎組織中趨化因子(CCL2)和炎癥因子(IL-1β和IL-6) mRNA水平顯著降低(Fig. 4B)。RT-PCR結(jié)果顯示，Cdh16Cre-ACSL4F/F的小鼠腎組織中趨化因子(CCL2)和炎癥因子(IL-1β和IL-6) mRNA水平顯著降低(Fig. 4C)。流式細胞術分析顯示CD11b+F4/80+巨噬細胞在Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠腎臟的浸潤明顯減少(Fig. 4D)。血常規(guī)和免疫組化實驗也顯示腎臟單核細胞減少，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠巨噬細胞浸潤減少((Fig. 4E，F(xiàn))?？偟膩碚f，敲除ACSL4可以減少I/ r誘導小鼠腎臟中的炎癥和巨噬細胞聚集

Fig.4 敲除腎臟ACSL4可抑制腎臟炎癥因子的釋放

5、鐵死亡細胞誘導巨噬細胞招募中性粒細胞

AKI小鼠中性粒細胞趨化因子顯著升高，Cdh16Cre-ACSL4F/F小鼠中性粒細胞趨化因子顯著降低（Fig.5A）。流式細胞術、血常規(guī)及免疫組化實驗證實了中性粒細胞中Cdh16Cre-ACSL4F/F下調(diào)作用(Fig. 5B–D)。因此，作者利用鐵細胞和中性粒細胞進行體外趨化實驗，以確定中性粒細胞是否也被鐵死亡細胞招募。然而，嗜中性粒細胞不能被鐵死亡細胞吸收(Fig. 5E). 此外，鐵死亡細胞不誘導趨化因子的產(chǎn)生(Fig. 5F)。研究表明，巨噬細胞釋放趨化因子招募粒細胞到損傷部位。由于鐵細胞誘導的巨噬細胞CXCL1和CXCL2的表達水平上調(diào)，巨噬細胞可能會誘導巨噬細胞招募中性粒細胞(Fig. 4H)。體外趨化實驗也顯示嗜中性粒細胞被巨噬細胞招募(Fig. 5G)。此外，嗜鐵抑制劑Fer-1下調(diào)CXCL1的表達水平， CXCL2及腎臟中性粒細胞浸潤(Fig. 5H,I)。因此，鐵細胞間接招募中性粒細胞，提供了鐵細胞在AKI中的另一種促炎作用。盡管如此，cdh16crea - acsl4F/F能有效抑制這種促炎作用。

Fig.5 巨噬細胞通過分泌中性粒細胞趨化因子來招募中性粒細胞

6. ACSL4抑制劑羅格列酮(Rosi) 通過抑制鐵死亡和炎癥保護AKI的腎功能

ACSL4抑制劑Rosi用于進一步驗證ACSL4在AKI中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R+Rosi組降低了血液CRE、腎臟指數(shù)，減輕了病理性腎臟損傷(Fig. 6A–C)。此外，Rosi下調(diào)了ACSL4、CCL2、CXCL1和CXCL2的水平(Fig. 6D)。免疫組織化學和流式細胞術顯示I/R+Rosi組腎巨噬細胞浸潤較少(Fig. 6E，F)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明Rosi對AKI有保護作用，減少炎癥細胞的浸潤，提示ACSL4在AKI中發(fā)揮重要作用。

Fig. 6. ACSL4抑制劑羅格列酮(Rosi)通過抑制鐵下垂和炎癥來保護AKI患者的腎功能

本研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4是通過抑制鐵下垂來預防和治療AKI的潛在靶點。HIF-1α通過結(jié)合ACSL4啟動子，負向調(diào)控ACSL4的表達；鐵細胞招募巨噬細胞并刺激巨噬細胞招募中性粒細胞，從而引起AKI的炎癥級聯(lián)反應。本研究結(jié)果為AKI和鐵死亡相關疾病新治療方法的開發(fā)提供了參考。

參考文獻：

Wang Y, Zhang M, Bi R, et al. ACSL4 deficiency confers protection against ferroptosis-mediated acute kidney injury[J]. Redox Biology, 2022: 102262.