心律失常性心肌病的潛在新療法:crenolanib藥物抑制PDGFRA

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-03-21
本研究結(jié)果表明,PDGFRA信號(hào)通路與DCM發(fā)病機(jī)制有關(guān),抑制該通路可能是flnc相關(guān)心肌病的一種治療策略本研究于2022年2月發(fā)表在......


FLNC截?cái)嗤蛔儯?/span>FLNCtv)是遺傳性擴(kuò)張型心肌病(DCM)的常見(jiàn)病因,是發(fā)展成心律失常性心肌病的高危因素。本研究結(jié)果表明,PDGFRA信號(hào)通路與DCM發(fā)病機(jī)制有關(guān),抑制該通路可能是flnc相關(guān)心肌病的一種治療策略本研究于20222月發(fā)表在《Science AdvancesIF:14.136雜志上。

 

技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:

1、使用患者特異性多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞(iPSC-CMs)構(gòu)建FLNC-相關(guān)DCM模型

作者從FLNCG1891Vfs61XFLNCCE2189XDCM患者身上分離出iPSC細(xì)胞,然后誘導(dǎo)成iPSC-CMs,并探究其電生理學(xué)屬性,結(jié)果顯示與健康對(duì)照組相比,FLNCtv患者的iPSC-CMs均表現(xiàn)出較弱的收縮性和較慢的放松性Fig. 1 A and B)。兩種患者特異性iPSC-CMs也表現(xiàn)為自發(fā)性心律失常Fig. 1 C)。與對(duì)照組iPSC-CMs相比,心律失常表型也表現(xiàn)為心率的較大變異(Fig. 1 D)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證心律失常的表型,檢測(cè)了健康和iPSC-CMs患者的動(dòng)作電位(AP)形態(tài)。與收縮數(shù)據(jù)一致,40%FLNCG1891Vfs61X36%FLNCCE2189X iPSC-CMs與對(duì)照iPSC-CMs相比出現(xiàn)異常AP形態(tài)(Fig. 1 E and F)??傊?,這些數(shù)據(jù)表明,FLNC患者iPSC-CMs概述了體外與FLNC相關(guān)的DCM相關(guān)的心律失常表型。

1 FLNCG1891Vfs61X and FLNCE2189X iPSC-CMs 表現(xiàn)出收縮性受損和心律失常

 

2、FLNCG1891Vfs61XFLNCCE2189X都是缺失突變體其導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全

接下來(lái)檢測(cè)了患者特異性iPSC-CMsFLNC的表達(dá)水平,通過(guò)免疫印跡和qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組iPSC-CMs相比,FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X突變體表達(dá)FLNC蛋白和mRNA水平均顯著降低(Fig. 2 A to C)。盡管FLNC表達(dá)水平降低,但通過(guò)免疫熒光染色和共定位分析,能夠在兩個(gè)FLNC突變的iPSC-CM細(xì)胞系中檢測(cè)到FLNC及其與α- actitin在Z-discz盤的共定位(Fig. 2D)。

為了探究FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X是否是功能丟失的突變體,為FLNC缺失的iPSC系和等基因?qū)φ障导?xì)胞生成了差異表達(dá)基因(DEG)譜,并與iPSC- CMs患者的DEG譜進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了FLNC純合子(FLNCKO?/?)和雜合子(FLNCKO+/?)敲除的iPSC-CMs(Fig. 2 E to H)。FLNCKO?/?和FLNCKO+/?iPSC-CMs中FLNC的表達(dá)在mRNA和蛋白水平上均以等位基因依賴的方式顯著降低。RNA測(cè)序生物信息學(xué)分析顯示,F(xiàn)LNC截?cái)嗤蛔冎械腄EGs與FLNC KO iPSC-CMs中的DEGs呈正相關(guān),支持功能缺失是FLNC突變引起表型表現(xiàn)的主要機(jī)制(Fig. 2I)。此外,攜帶FLNC突變的iPSC-CMs顯著降低了ID蛋白水平;FLNC KO iPSC-CMs也有相同的發(fā)現(xiàn)(Fig. 2J)。最后,F(xiàn)LNCKO?/?細(xì)胞表現(xiàn)出與患者iPSC-CMs相似的心律失常表型(Fig. 1 E and F)??傊@些結(jié)果說(shuō)明FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X都是缺失突變體其導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全。

 

2 FLNCG1891Vfs61X and FLNCE2189X的功能缺失突變導(dǎo)致FLNC相關(guān)心肌病的單倍機(jī)能不全

 

3FLNC缺失導(dǎo)致β-Catenin核定位和β-Catenin信號(hào)通路的激活

為了發(fā)現(xiàn)FLNC的分子伴侶,進(jìn)行了共免疫沉淀和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了β-Catenin,經(jīng)免疫印跡證實(shí)Fig. 3A)。在FLNCKO?/? iPSC-CMs的裂解液中沒(méi)有檢測(cè)到β-Catenin,而且在FLNC突變的iPSC-CMs的裂解液中β-Catenin的水平也減少了Fig. 3A)。此外,在FLNC -突變體和FLNCKO?/? iPSC-CMs的細(xì)胞核中檢測(cè)到大量的β-Catenin,而對(duì)照iPSC-CMsβ-Catenin主要在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到(Fig. 3B-C)。此外,FLNC -突變體和FLNCKO?/? iPSC-CMsRNA-seq數(shù)據(jù)表達(dá)譜顯示β-Catenin信號(hào)通路激活(Fig. 3D)??傊瑪?shù)據(jù)表明β-Catenin可能是一種新的FLNC結(jié)合伙伴和FLNC的下游效應(yīng)物,并且iPSC-CMsFLNC的缺失導(dǎo)致β-Catenin從胞漿遷移到細(xì)胞核,導(dǎo)致β-Catenin信號(hào)的激活。

3 β-CateninFLNCFLNC激活的β-Catenin信號(hào)通路的缺失有關(guān)

 

4、PDGFRAFLNC相關(guān)心肌病中上調(diào)并且是β-Catenin的下游調(diào)控因子

為鑒定更多的下游靶點(diǎn)用于藥物開(kāi)發(fā),作者比較了FLNCKO?/?FLNCKO+/?iPSC-CMs的轉(zhuǎn)錄組以鑒定潛在靶基因。如圖Fig. 4A所示,FLNCKO?/?FLNCKO+/?iPSC-CMs的轉(zhuǎn)錄組有接近相似的上調(diào)和下調(diào)DEGs。對(duì)兩者間共有的上調(diào)和下調(diào)DEGs進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與調(diào)控cell-cell adhesion, intercellular communication,ion transport等通路Fig. 4B to D)。此外,這些上調(diào)的DEGs主要富集至PDGF分子水平的結(jié)合活性Fig. 4E)。數(shù)據(jù)顯示,與等基因?qū)φ盏?/span>iPSC-CMs相比,FLNC KO系中PDGFRA的表達(dá)水平顯著提高了4倍(Fig. 4F)。由于數(shù)據(jù)表明,FLNCG1681Vfs61XFLNCE2189X突變導(dǎo)致單倍功能不全,作者假設(shè)攜帶這些突變的iPSC-CMs患者的PDGFRA水平也可能升高。如Fig. 4G to H所示,與對(duì)照組相比,兩種患者來(lái)源的iPSC-CMsPDGFRA均上調(diào)??傊?,這些發(fā)現(xiàn)提示PDGFRA信號(hào)通路的激活與FLNC相關(guān)心肌病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

4細(xì)胞粘附途徑的失調(diào)導(dǎo)致PDGFRAFLNC相關(guān)心肌病發(fā)病機(jī)制中的激活

 

β-Catenin被認(rèn)為可以上調(diào)PDGFRA在其他組織和/或疾病中的表達(dá)。由于觀察到β-CateninFLNC缺失的iPSC-CMs中有顯著的核定位,于是研究了β-CateninPDGFRA上游轉(zhuǎn)錄激活因子的假設(shè)。因此,使用β-Catenin抑制劑(JW67JW74)在不同濃度下抑制β-Catenin,并觀察到PDGFRA轉(zhuǎn)錄水平的劑量依賴性抑制Fig. 5A)。此外,ChIP下拉實(shí)驗(yàn)表明,已知的轉(zhuǎn)錄因子和β-Catenin結(jié)合伙伴SOX2PDGFRA啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合(Fig. 5B)??傊?,數(shù)據(jù)表明β-CateninPDGFRA的轉(zhuǎn)錄激活因子,并且β-Catenin的核定位導(dǎo)致PDGFRAFLNC缺失的iPSC-CMs中持續(xù)上調(diào)。

5 β-Catenin可能是PDGFRA的轉(zhuǎn)錄激活因子

 

5、PDGFRA抑制挽救了connexin 43的膜定位

研究顯示PDGFRA通過(guò)激活MAPK/ERK信號(hào)通路,破壞細(xì)胞膜上connexin43(縫隙連接蛋白-1 (GJA1))的信號(hào)。作者發(fā)現(xiàn),與對(duì)照iPSC-CMs相比,FLNC突變體和KO iPSC-CMsERK激活并且GJA1離開(kāi)細(xì)胞膜Fig. 6A)。為了測(cè)試FLNC倍不足的iPSC-CMs中PDGFRA的激活是GJA1定位錯(cuò)誤的原因,使用FDA批準(zhǔn)的藥物crenolanib對(duì)PDGFRA進(jìn)行藥物抑制,以確定對(duì)GJA1膜定位的影響。免疫熒光研究表明,crenolanib抑制PDGFRA可以挽救GJA1在膜上的定位(Fig. 6A)。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示,與FLNCG1891Vfs61X和KO iPSC-CMs相比,F(xiàn)LNCE2189X突變體iPSC-CMs對(duì)crenolanib的反應(yīng)最大,拯救的DEGs數(shù)量最多(Fig. 6B)。GSEA揭示了細(xì)胞粘附途徑(hsa04510)的部分正?;?,支持了cell-cell adhesion位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定促進(jìn)了GJA1粘附在細(xì)胞膜上的假設(shè)(Fig. 6C)。然而,通過(guò)免疫印跡檢測(cè),發(fā)現(xiàn)crenolanib處理后GJA1的表達(dá)水平?jīng)]有改變,這表明PDGFRA抑制并不影響GJA1的表達(dá)水平,而是影響GJA1的轉(zhuǎn)運(yùn)(Fig. 6D)。最后,也是最重要的一點(diǎn)是,crenolanib處理也顯著改善了來(lái)自FLNC患者的iPSC-CMs的收縮性,并減少了心律失常,但對(duì)健康對(duì)照組而言并非如此(Fig. 6E-F)。綜上,說(shuō)明FLNC缺失導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞黏附系統(tǒng)失調(diào),抑制PDGFR信號(hào)通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性.

 

6 FLNC缺失導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞黏附系統(tǒng)失調(diào),抑制PDGFR信號(hào)通路改善FLNC突變體iPSC-CMs的收縮性

 

6、PDGFRA抑制減弱了β-catenin核定位

通過(guò)免疫熒光檢測(cè)到,與對(duì)照組iPSC-CMs相比,FLNC突變體iPSC-CMsβ-catenin的核定位增加,但在crenolanib處理后,β-catenin的核定位減少Fig. 7A)。qPCR證實(shí)crenolanib處理對(duì)β-catenin核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用,β-catenin靶基因TCF4、SOX9、COL1A2、TGF 3的轉(zhuǎn)錄水平降低(Fig. 7B)。此外,通過(guò)GSEA分析比較crenolanib治療前后患者源性和KO iPSC-CMs的DEGs譜,進(jìn)一步證實(shí)PDGFRA信號(hào)抑制后β-catenin信號(hào)通路部分恢復(fù)(Fig. 7C-D)。因此,證據(jù)表明PDGFRA的激活增強(qiáng)了β-catenin信號(hào),并促進(jìn)了一個(gè)正反饋回路。此外,PDGFR抑制可以部分恢復(fù)β-catenin膜定位,減少FLNCtv突變引起的β-catenin的激活。

7 PDGFRA抑制減緩了β-catenin信號(hào)通路及其在FLNC突變體iPSC-CMs中的核定位

 

7、a-DCMPDGFRA信號(hào)的激活

為了證實(shí)體外研究的結(jié)果,測(cè)定了a-DCM患者心臟中PDGFRA的表達(dá)水平。在a-DCM患者中(n = 5), 1例患者是FLNCG1891V61X突變的姐妹。另外4例患者診斷為特發(fā)性DCM合并室性心律失常。發(fā)現(xiàn)a-DCM患者心臟PDGFRA水平升高, PDGFRA下游效應(yīng)物ERK被激活Fig. 8A and B)。此外,還確定了β-cateninGJA1DCM心臟中的表達(dá)水平和定位。雖然β-cateninGJA1的表達(dá)水平結(jié)果保持不變,但免疫熒光染色檢測(cè)到β-cateninGJA1從細(xì)胞膜上分離(Fig. 8C and E)。此外,移植心臟的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示,與DCM (n = 15)和未衰竭心臟(n = 12)相比,a-DCM (n = 20)心臟中PDGFRA mRNA的豐度顯著更高Fig. 8F)。RNA-seq數(shù)據(jù)經(jīng)qPCR驗(yàn)證,如Fig. 8G所示。此外,各組間PDGFRB mRNA轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生變化,提示FLNC突變引起a-DCM的致病機(jī)制是特異性于PDGFRA亞型的(Fig. 8F)??傊?,證實(shí)了來(lái)自患者特異性和KO iPSC-CM系和人類a-DCM移植心臟的體外發(fā)現(xiàn),強(qiáng)烈表明PDGFRA促進(jìn)a-DCM的致病信號(hào)傳導(dǎo)。

8 PDGFRA的上調(diào)有助于GJA1β-catenin在心律失常性擴(kuò)張型心肌病心臟的離域

 

總之,如圖9,本研究發(fā)現(xiàn)β-cateninFLNC的下游靶點(diǎn),FLNC單倍不足不僅影響cell-cell adhesion、細(xì)胞骨架和肌肉組織,還增加β-catenin的核遷移,進(jìn)而上調(diào)PDGFRA的轉(zhuǎn)錄。隨后PDGFRA信號(hào)的激活可能是FLNC突變體iPSC-CMs中觀察到的收縮功能障礙和電不穩(wěn)定的原因。FLNC 單倍不足和隨后PDGFRA激活引起的心律不齊的表現(xiàn)型至少部分是由于GJA1位移引起的細(xì)胞膜的幾種機(jī)制導(dǎo)致的,如PDGFRA下游靶點(diǎn)ERK磷酸化,ID中斷和異常易位。

9 FLNC相關(guān)心肌病的疾病模型

 

參考文獻(xiàn):

Chen Suet Nee., Lam Chi Keung., Wan Ying-Wooi., Gao Shanshan., Malak Olfat A., Zhao Shane Rui., Lombardi Raffaella., Ambardekar Amrut V., Bristow Michael R., Cleveland Joseph., Gigli Marta., Sinagra Gianfranco., Graw Sharon., Taylor Matthew R G., Wu Joseph C., Mestroni Luisa.(2022). Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Adv, 8(8), eabk0052. doi:10.1126/sciadv.abk0052