新思路：Pink1支持神經(jīng)元局部線粒體自噬

PTEN誘導(dǎo)的激酶1 (PINK1)是一種短命蛋白，是Parkin易位和線粒體自噬去除受損的線粒體所必須的。由于PINK1的半衰期較短，限制了其進(jìn)入神經(jīng)突的能力，因此要使這一線粒體自噬途徑在遠(yuǎn)離體細(xì)胞的地方活躍起來，就需要進(jìn)行局部翻譯。Pink1轉(zhuǎn)錄本和神經(jīng)元線粒體相關(guān)并轉(zhuǎn)運(yùn)的。與轉(zhuǎn)運(yùn)相一致，線粒體外膜結(jié)合蛋白突觸小泡磷酸酶2（SYNJ2）和其結(jié)合蛋白（SYNJ2BP）都是將Pink1 mRNA連接到線粒體所必須的通過SYNJ2的RNA結(jié)合域。這種對PINK1局部翻譯的神經(jīng)元特異性適應(yīng)為遠(yuǎn)端線粒體提供了持續(xù)的PINK1供應(yīng)，以激活線粒體自噬。本研究于2022年2月發(fā)表在《Neuron》IF：17.173期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、軸突中的PINK1活動需要局部翻譯

為了確定PINK1在哺乳動物神經(jīng)元中的半衰期，我們檢測了iPSC來源的神經(jīng)元中內(nèi)源性PINK1的穩(wěn)定性和清除性（Figures 1A and 1B）。在CCCP介導(dǎo)的線粒體去極化后PINK1水平升高，這種作用被蛋白合成抑制劑CHX阻止。在CCCP洗脫后，PINK1水平在30min內(nèi)降至基線水平，表明PINK1持續(xù)切割導(dǎo)致極化線粒體中PINK1蛋白水平保持在較低豐度。在健康的線粒體中，這種快速降解會抑制突觸和軸突中PINK1的運(yùn)輸。然而，PINK1 mRNA局部轉(zhuǎn)運(yùn)可以支持局部線粒體自噬。于是作者探究在CHX存在的情況下YFP-Parkin線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)是否發(fā)生。AA處理將Parkin線粒體共定位提高了10-29%（Figures 1C and 1D）。在AA前4小時，將CHX應(yīng)用于軸突室，消除了80%的這種增加（Figures 1D）。因此，軸突局部轉(zhuǎn)運(yùn)會導(dǎo)致Parkin依賴的線粒體自噬。

Pink1轉(zhuǎn)錄本的相對豐度和一個已知的體細(xì)胞限制表達(dá)的RNA，γ-actin，被測定并校正到線粒體rRNA的數(shù)量。雖然γ-actin很少，但在軸突部分容易檢測到Pink1 mRNA（Figures 1E）。隨后作者檢測了體內(nèi)是否有Pink1表達(dá)，結(jié)果顯示外源性Pink1 mRNA已被運(yùn)輸?shù)揭暽窠?jīng)，而對照組的GFP轉(zhuǎn)錄本幾乎沒有出現(xiàn)在軸突（Figures 1F）。

之后，作者利用光轉(zhuǎn)換蛋白Kaede探究了PINK1在軸突中的翻譯情況（PINK1-NKaede），Kaede 使用通用的 mito 靶向域（mito-Kaede）靶向線粒體作為對照。曝光后 45 分鐘，來自 PINK1-N-Kaede 融合蛋白的綠色 Kaede 信號出現(xiàn)在軸突線粒體中，相比之下，mito-Kaede 的信號僅進(jìn)一步下降（Figures 1G and 1H）。這表明遠(yuǎn)端軸突的PINK1蛋白可能由局部翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)提供。

圖1軸突中的PINK1活動需要局部翻譯

2、神經(jīng)元中Pink1 mRNA定位于線粒體

原位雜交的結(jié)果顯示內(nèi)源性Pink1 mRNA出現(xiàn)在軸突和樹突的斑塊中，與線粒體蛋白ATP5a共定位（Figure 2A）。STED成像顯示Pink1 mRNA信號分解成多個小點(diǎn)狀點(diǎn)在每個線粒體上，相反，β-actin mRNA幾乎不與線粒體重疊（Figure 2B）。

對于神經(jīng)元中Pink1 mRNA的實(shí)時成像，使用MS2/PP7-splitVenus方法（Figure 2C），將12個PP7和MS2串聯(lián)莖環(huán)添加到一個大鼠Pink1結(jié)構(gòu)體中，該結(jié)構(gòu)體包含該基因的3’和5’UTR。為了防止PINK1的過表達(dá)活性，這會限制線粒體運(yùn)動，作者引入了kinase死亡突變（K219M）。這種帶有莖環(huán)標(biāo)記的Pink1 mRNA在體細(xì)胞和樹突中很容易被檢測到。軸突中檢測到的Pink1是有限的，雖然在近端軸突觀察到很多小的Pink1 mRNA點(diǎn)，并且它們主要和線粒體共定位（Figure 2D）。通過這兩種方法，當(dāng)用Mander相關(guān)系數(shù)量化時，共定位是顯著的。為了排除軸突線粒體的相對頻率會隨機(jī)產(chǎn)生相同的重疊，將直線圖像的線粒體通道翻轉(zhuǎn)，原始圖像的共定位程度明顯高于翻轉(zhuǎn)對照圖像（Figures 2E–2G）。觀察到體細(xì)胞和樹突的共定位重疊明顯高于相應(yīng)的翻轉(zhuǎn)圖像（Figures 2E–2G）。此外，β-actin mRNA與線粒體共定位點(diǎn)也能觀察到，但不存在于體細(xì)胞只存在于樹突，并且無論是在樹突還是體細(xì)胞，Pink1 mRNA點(diǎn)和線粒體共定位明顯更高（Figures 2E–2G）?？傊@些結(jié)果說明神經(jīng)元中Pink1 mRNA定位于線粒體。

圖2神經(jīng)元中Pink1 mRNA定位于線粒體

3、Pink1 mRNA與線粒體共轉(zhuǎn)運(yùn)

由于軸突中Pink1顆粒的實(shí)時成像受到限制，作者主要分析了樹突中mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)（Figure 3A）。大多數(shù)Pink1 mRNA顆粒及其相關(guān)的線粒體是靜止不動的，正如樹突中固定線粒體的優(yōu)勢所預(yù)期的那樣（紅色箭頭，F(xiàn)igure 3A）。然而，在運(yùn)動線粒體上也存在Pink1 mRNA顆粒（黃色箭頭，F(xiàn)igure 3A），它們的運(yùn)動反映了細(xì)胞器的運(yùn)動，這可以從它們重疊的紋波圖痕跡中看出（Figure 3A）?？偟膩碚f，在觀察的整個過程中，樹突和軸突中的mRNA和線粒體都保持在一起，89%的Pink1 mRNA與線粒體同步移動，在無法檢測到相應(yīng)線粒體痕跡的情況下，mRNA顆粒是靜止的或只移動了很短的距離（Figures 3B-3C）。文獻(xiàn)報(bào)道具有催化活性的PINK1過表達(dá)抑制線粒體運(yùn)動，因此，比較了野生型(WT)和失活的PINK1 K219M mRNA的線粒體運(yùn)動性。和預(yù)期一樣，當(dāng)Pink1蛋白WT形式表達(dá)時，Pink1 mRNA顆粒的運(yùn)動時間比Pink1 K219M的表達(dá)少60%（Figure 3D）。

圖3 Pink1 mRNA與線粒體共轉(zhuǎn)運(yùn)

4、Pink1 mRNA與線粒體的關(guān)聯(lián)需要Pink1線粒體靶向序列的翻譯

為了確定Pink1 mRNA與線粒體結(jié)合的機(jī)制，表達(dá)了與BFP編碼序列融合的mRNA的截短序列（Figure 4）。BFP序列單獨(dú)與線粒體沒有關(guān)聯(lián)。使用MS2/PP7- splitVenus系統(tǒng)來探究Pink1轉(zhuǎn)錄本的某個部分是否可以將線粒體關(guān)聯(lián)傳遞到嵌合結(jié)構(gòu)上（Figure 4A）。盡管許多RBP結(jié)合在UTR內(nèi)，但Pink1 UTR都不足以誘導(dǎo)BFP轉(zhuǎn)錄本的線粒體定位，而且Pink1 C端部分和3’UTR的結(jié)合也不充分（Figure 4A）。然而，將PINK1的N端部分(ORF的1 675)和5’UTR包含在一起，就足以將mRNA定位于體、軸突和樹突中的線粒體（Pink1 5’UTR+N-BFP; Figures 4A, 4B）。Pink1 5’UTR+N-BFP編碼的225個氨基酸包括其起始密碼子和線粒體靶向序列（MTS），提示線粒體定位可能需要翻譯。事實(shí)上，在翻譯抑制劑嘌呤霉素的存在下，全長Pink1的表達(dá)改變了Pink1 mRNA的分布。孵育1 h后，全長Pink1 mRNA從線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中（Figures 4C）。類似地，缺乏起始密碼子的結(jié)構(gòu)不能定位于線粒體（Figures 4A, 4D）。PINK1的MTS是否足以將其mRNA定位到線粒體呢？作者表達(dá)了Pink1與BFP融合的5’UTR和MTS (Pink1 5’UTR+MTS-BFP)，雖然BFP融合蛋白定位于線粒體，但嵌合的Pink1/BFP轉(zhuǎn)錄本仍然是胞質(zhì)的（Figures 4E）。這些結(jié)果說明Pink1 mRNA與線粒體的關(guān)聯(lián)需要Pink1線粒體靶向序列的翻譯。于是這促使作者進(jìn)一步探究RBPs在Pink1 mRNA定位中的作用。

圖4 PINK1線粒體靶向序列的翻譯是必要的，但不足以使PINK1 mRNA與線粒體關(guān)聯(lián)

5、SYNJ2BP敲低將Pink1 mRNA重新分配到RNA顆粒，抑制局部線粒體自噬

最近的研究已經(jīng)將SYNJ2BP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體RNA的定位連接到外線粒體膜。當(dāng)SYNJ2BP在神經(jīng)元中被敲低時，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元體中Pink1 mRNA與線粒體的關(guān)聯(lián)減少，樹突中Pink1 mRNA與線粒體的關(guān)聯(lián)減少（Figures 5A and 5B）?？箂hRNA SYNJ2BP的表達(dá)挽救了這些影響（Figures 5B）。Pink1 mRNA在體中形成較大的聚集物，與RFP-DDX6共定位，RFP-DDX6是加工體的標(biāo)記（Figures 5C）。與對Pink1 mRNA的影響相反，SYNJ2BP敲低后，β-actin mRNA和RFP-DDX6的共定位沒有改變。這表明SYNJ2BP缺失對Pink1 mRNA的定位具有選擇性影響。

圖1提到Pink1 mRNA與線粒體關(guān)聯(lián)和共轉(zhuǎn)運(yùn)需要SYNJ2BP，這預(yù)示著，敲低SYNJ2BP可以阻止Pink1 /Parkin通路的軸突線粒體自噬的局部激活。與Pink1 mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的需要相一致，SYNJ2BP基因的敲除降低了AA誘導(dǎo)的軸突遠(yuǎn)端線粒體自噬的發(fā)生率（Figures 5D）。為了測量PINK/Parkin通路的功能，對磷酸化泛素(PINK1的直接下游產(chǎn)物)進(jìn)行染色。在AA處理后，神經(jīng)突線粒體磷泛素的增加被SYNJ2BP敲除所廢止。

總之，以上表明SYNJ2BP敲低將Pink1 mRNA重新分配到RNA顆粒，抑制局部線粒體自噬。

圖5 SYNJ2BP敲低使Pink1 mRNA重新分布到RNA顆粒中，并抑制局部線粒體自噬

6、Pink1 mRNA對線粒體的定位是神經(jīng)元特異性的，依賴于SYNJ2a

在包括COS-7、HeLa細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在內(nèi)的非神經(jīng)元細(xì)胞中，Pink1 mRNA不在線粒體上（Figures 6A）。因此，該轉(zhuǎn)錄本的線粒體關(guān)聯(lián)可能是神經(jīng)元特異性的。在這些細(xì)胞類型中缺乏線粒體定位，這讓人不禁要問，缺失的神經(jīng)元成分需要什么帶來Pink1 mRNA在非神經(jīng)元細(xì)胞中傳遞到線粒體。由于SYNJ2BP普遍表達(dá)，作者首先探究了其相互作用分子SYNJ2a或ER蛋白核糖體結(jié)合蛋白1 (RRBP1，在神經(jīng)元中富集)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Synj2a轉(zhuǎn)錄本在海馬培養(yǎng)中比成纖維細(xì)胞高5倍（Figures 6B）。而成纖維細(xì)胞中Rrbp1的轉(zhuǎn)錄水平高出7倍（Figures 6C）。類似地，SYNJ2蛋白在神經(jīng)元中比成纖維細(xì)胞中更豐富，而RRBP1則相反（Figures 6D）。

在COS-7細(xì)胞中過表達(dá)SYNJ2a和SYNJ2BP使Pink1 mRNA重新定位于線粒體（Figures 6E-6F）。相反，過表達(dá)SYNJ2BP的相關(guān)蛋白SYNJ1并沒有改變Pink1胞質(zhì)定位。SYNJ2a過表達(dá)對Pink1 mRNA的影響是選擇性的，β-actin mRNA始終留在細(xì)胞質(zhì)中（Figures 6E-6F）。此外，SYNJ2BP和SYNJ2a的過表達(dá)也導(dǎo)致線粒體聚類（Figures 6E）。因此，SYNJ2作為Pink1 mRNA的線粒體錨點(diǎn)，與Pink1初生鏈的協(xié)同翻譯靶標(biāo)一致。

圖6 Pink1 mRNA對線粒體的定位是神經(jīng)元特異性的，依賴于SYNJ2a

7、RNA結(jié)合SYNJ2是Pink1 mRNA定位至線粒體所必須的

接下來進(jìn)一步研究SYNJ2作為Pink1 mRNA的線粒體錨點(diǎn)的具體效應(yīng)及其必須性。在HEK細(xì)胞中表達(dá)了SYNJ2的myc-tagged RRM結(jié)構(gòu)域，并使用254 nm紫外交聯(lián)和免疫沉淀CLIP技術(shù)。這說明RRM結(jié)構(gòu)域可以與RNA交聯(lián)，VQL殘基向丙氨酸的突變破壞這種結(jié)合能力，阻止了交聯(lián)物種的出現(xiàn)（Figure 7A）。為了確定SYNJ2a的RNA結(jié)合特性是否足以將Pink1 mRNA靶向到線粒體，作者創(chuàng)建了WT和VQL/AAA版本的人工錨點(diǎn)，其SYNJ2a通過跨膜結(jié)構(gòu)域靶向到線粒體表面，即使不存在SYNJ2BP。結(jié)果顯示，在神經(jīng)元中過表達(dá)過表達(dá)SYNJ2mito足以克服SYNJB2P敲除和選擇性重定位Pink1 mRNA到線粒體（Figure 7B-7C）。而SYNJ2mito VQL/AAA表達(dá)后，Pink1 mRNA則保持在胞質(zhì)（Figure 7B-7C）。因此，SYNJ2的RNA結(jié)合能力可以介導(dǎo)Pink1 mRNA在線粒體中的定位。

之后，作者對SYNJ2mito WT或VQL/AAA突變體的HEK細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選關(guān)鍵的基因（Figure 7D）。該分析產(chǎn)生了800多個優(yōu)先綁定到SYNJ2mito WT(包括Pink1)的轉(zhuǎn)錄本。作者對檢測到的和已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行重疊，但兩種數(shù)據(jù)間重疊性很?。‵igure 7E）。這支持了SYNJ2a在獨(dú)立于SYNJ2BP介導(dǎo)的RNA結(jié)合而介導(dǎo)線粒體轉(zhuǎn)錄本亞組轉(zhuǎn)運(yùn)中的獨(dú)特作用。

圖7 SYNJ2a的結(jié)合對于Pink1 mRNA定位到線粒體是必要的

參考文獻(xiàn)：

Harbauer Angelika B., Hees J Tabitha., Wanderoy Simone., Segura Inmaculada., Gibbs Whitney., Cheng Yiming., Ordonez Martha., Cai Zerong., Cartoni Romain., Ashrafi Ghazaleh., Wang Chen., Perocchi Fabiana., He Zhigang., Schwarz Thomas L.(2022). Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron, undefined(undefined), undefined. doi:10.1016/j.neuron.2022.01.035