尼魯單抗可提高PD-1+處理的人結腸癌細胞的存活率，并可保護腫瘤細胞免受傳統(tǒng)療法的傷害

結直腸癌(CRC)是世界范圍內最常見、最致命的腫瘤之一。大多數(shù)的CRC對以抗程序性細胞死亡蛋白-1 (PD-1)為基礎的癌癥免疫治療耐藥。約15%具有高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、高腫瘤突變負擔和腫瘤內淋巴細胞浸潤。腫瘤相關的巨噬細胞已經成為轉移的關鍵因素。PD-1信號通路激活致癌功能，而在肺癌細胞中，它具有腫瘤抑制作用。本研究工作旨在評估抗PD -1 尼魯單抗 (NIVO)藥物治療CRC的效果。本研究于2022年3月發(fā)表于《Journal for Immuno Therapy of cancer》，IF=13.751。

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本文主要內容：

1. PD-1阻斷增加結腸癌細胞生長

首先，在人結腸癌細胞中評估PD-1和PD-L1水平。在HT29、HCT116、LoVo、SW620和Colo205細胞中檢測到PD-1，但未檢測到PD-L1 (Fig 1A)。與SW620和Colo205細胞相比，HT29、HCT116和LoVo細胞明顯過表達PD-1。已有研究表明，當IFN誘導PD-L1時，I型(IFN-α)和II型(IFN-γ)干擾素帶來的影響取決于PD-1和PD-L1的表達。在HT29和HCT116細胞蛋白水平和轉錄組水平上，IFN-α和IFN-γ均不能誘導PD-1，而IFN-α和IFN-γ均能誘導PD-L1 (Fig 1B)。為評估細胞PD-1信號通路在結腸癌細胞凋亡和細胞生長中的作用。人結腸癌細胞 HT29、HCT116和LoVo用可溶性PD-L1和 NIVO進行處理。如Fig 1C所示，sPD-L1增加了HT29、HCT116和LoVo細胞凋亡。如Fig 1D所示，NIVO促進了細胞增長，而sPD-L1抑制了其生長。 在HT29和HCT116細胞中，六個小時NIVO(10 μM)處理誘導pERK表達，但是NIVO (10 μM)降低了人黑色素瘤細胞PES43的pERK (Fig 1E)。

此外，6小時NIVO(10 μM)增加了HT29中pP38的含量，但NIVO對K-RAS突變細胞HCT116中的pP38無影響(Fig 2C)。相反， 6小時NIVO(10 μM)處理減少了PES43中pP38水平，這些數(shù)據(jù)表明PD-1通過抑制P38和ERK信號通路抑制細胞增殖。

為了進一步研究下游信號通路在PD-1介導的細胞增殖中的作用，作者在MEK/ ERK1/2/AKT/P38抑制劑存在下評價HT29和HCT116細胞的生長，結果發(fā)現(xiàn)，激酶抑制劑顯著恢復了NIVO誘導的HT29細胞的生長。在HCT116中，AKT和MEK/ERK1/2抑制劑都能恢復NIVO誘導的細胞生長，而正如預期的那樣，P38抑制劑不影響細胞增殖。

Fig 1 PD-1阻斷增加結腸癌細胞生長

 
2.NIVO保護結腸癌細胞免受化療/放療傷害，并增強球狀生長

為了研究PD-1信號通路對化療的影響，作者在 NIVO存在的情況下，用5-FU、OXA、CDDP、DOXO、IRI和TAX治療人結腸癌細胞72小時。結果發(fā)現(xiàn)，NIVO 降低了化療療效，增加了HT29、HCT116和LoVo的5-FU、OXA和IRI水平。此外，在HT29、HCT116和LoVo細胞中，5-FU和OXA加入NIVO后，細胞凋亡率降低(Fig 2A)。

NIVO存在的HCT116和HT29細胞暴露于2-4-8 Gyx射線中(Fig 2B i)。在HT29和HCT116細胞中，NIVO增強了對輻射的抵抗力，促進細胞生長(Fig 2B i)。NIVO- f (ab)2 (1μM)處理與NIVO處理效果相同(Fig 2B ii)。

此外，為了重現(xiàn)腫瘤細胞的三維相互作用和相對藥物敏感性，將人結腸癌細胞HT29、HCT116和SW620在球體和NIVO/中進行三維培養(yǎng)評價NIVO + OXA療效。從圖2C中可以看出，在HT29種用NIVO處理(10 μM)增強了HT29的球體平均面積，而在HT29、HCT116、HT29OXA、SW620中處理顯著減少了的球體平均面積?？傊?/span>NIVO抑制了OXA對HT29和HCT116球形細胞生長的影響，但對低表達PD-1的SW620細胞無影響。

Fig2 NIVO保護結腸癌細胞免受化療/放療傷害，并增強球狀生長

3. NIVO誘導人結直腸癌細胞差異基因表達

對HT29 和HCT116細胞用NIVO、sPD-L1、sPD-L1+NIVO進行6-24小時NIVO處理，并與PES43細胞比較，進行RNA測序。確定結腸癌細胞中治療影響的基因。如圖3A中的主成分分析(PCA)所示，HCT116、HT29和PES43獨立的聚為3類。6個小時的處理后，在PES43，HT29和HCT116中發(fā)現(xiàn)8306，618和3846個差異表達基因。24個小時的處理后，在PES43，HT29和HCT116中發(fā)現(xiàn)73121147和5410個差異表達基因。

作者重點研究了HT29、HCT116和PES43中共同調控的基因，分別在NIVO治療6小時和24小時后發(fā)現(xiàn)了149個和299個共同基因(Fig 3C)。在NIVO治療6小時和24小時時分別篩選19個(NIVO-6小時)和67個(NIVO-24小時)與PES43相關(Fig 3D)。

在處理6小時時，BATF2， IFIT3和TNFRSF11A在PES43中表達上調(Fig 4)。因此，6小時的NIVO治療可能會影響HT29和HCT116的基因表達，使HT29和HCT116具有更強的侵襲性表型，而PES43具有較弱的侵襲性表型，腫瘤抑制因子的減少和先天免疫反應、1-IFN信號通路和細胞因子介導的信號通路的調控基因相關，這些特征在治療24小時內保持不變(Fig 4)。在處理6個小時和24個小時的HT29和HCT116細胞中中分別篩選12個基因進行 qRT-PCR驗證，得到相同的結果。

Fig3 NIVO處理的人類結腸癌和黑色素瘤細胞中的差異表達基因(DEGs)

Fig4 Nivo處理的人類結腸癌和黑色素瘤細胞中差異表達基因(DEGs)的Go富集分析

4. NIVO增強HT29腫瘤的體內生長

以HT29異種移植模型評價NIVO效應。將HT29細胞接種于CD1胸腺病小鼠，當腫瘤達到50 mm3時，將小鼠隨機分為四組，每周兩次腹腔注射PBS (n=6)、NIVO (n=6)、OXA (n=6)以及NIVO +OXA聯(lián)合(n=6)治療3周。用HE評估腫瘤組織學。與體外實驗一致，NIVO顯著增加腫瘤生長1.88倍(Fig 5A)，提示PD-1阻斷可促進腫瘤生長，降低化療療效。同樣，與對照組相比，NIVO組腫瘤體積增大(Fig 5B)。與未處理組和與OXA聯(lián)合組相比，NIVO顯著增加了Ki-67表達細胞的比例(p=0.023) (p=0.027) (Fig 5C)。此外，NIVO和cleaved caspase-3檢測結果顯示，NIVO + OXA顯著降低了凋亡細胞的比例。此外，nivo處理的腫瘤與未處理的腫瘤相比，P38表達水平更高。有趣的是，在OXA處理的腫瘤中，pP38陽性細胞顯著降低(p=0.0061)，而在NIVO + OXA處理的腫瘤中，pP38陽性細胞增加(p=0.0047)，表明NIVO處理的腫瘤中細胞增殖更高。此外，與OXA治療組相比，OXA + NIVO組pERK1/2顯著升高。

癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫顯示，PD-1編碼的PDCD1基因在包括CRC在內的17種癌癥中被廣泛轉錄。然而，結腸癌組織中有浸潤的淋巴細胞。通過免疫組化分析48份石蠟包埋的結腸癌樣本中PD-1的表達情況。PD-1在TME和癌細胞中表達。臨床病理特征顯示原發(fā)性腫瘤的大小與PD-1的表達顯著相關，而且PD-1主要在結腸癌黏液組織中表達。

Fig5 PD-1阻斷加速皮下HT29腫瘤生長，降低化療療效

本提供了第一個PD-1靶向導致結腸癌放射/化療耐藥的報告。腫瘤細胞固有的PD-1/總PD-1表達可能代表CRC患者免疫檢查點阻斷選擇的潛在生物標志物。PD-1在結腸癌中的表達可促進腫瘤細胞生長，促進腫瘤生長。

參考文獻

Ierano, C., et al., In PD-1+ human colon cancer cells NIVOLUMAB promotes survival and could protect tumor cells from conventional therapies. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).