SUMOylation抑制增強多發(fā)性骨髓瘤對地塞米松的敏感性
多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細胞惡性腫瘤。地塞米松（Dex）是MM治療中使用最廣泛的治療藥物，但患者會產(chǎn)生Dex耐藥性，從而導致疾病的進展，因此迫切需要研究Dex耐藥的驅(qū)動機制，并開發(fā)新的試劑來解決這一問題。目前有研究認為SUMO化修飾是調(diào)節(jié)Dex抗性的潛在機制，而抑制SUMO化修飾可以增強MM對Dex定的敏感性。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 在原發(fā)病人樣本和細胞系中，抑制SUMOylation增強Dex抗MM的活性
作者前期通過數(shù)據(jù)庫和文獻得到MM漿細胞中較高的SUMO E1（UBA2）基因表達與更短的存活時間相關(guān)。隨后觀察到UBA2表達水平與Dex IC50s呈顯著正相關(guān)，提示UBA2表達與MM細胞Dex耐藥相關(guān)（圖1A）。
用TAK-981（一種新型的選擇性SUMO E1酶小分子抑制劑）處理MM1S細胞，檢測SUMOylated蛋白（圖1B）。TAK-981以劑量依賴的方式抑制整體SUMOylation，并誘導凋亡標志物cleaved PARP。然后，測試TAK-981單藥和Dex聯(lián)合治療對MM的影響。在從復發(fā)骨髓瘤患者分離的原發(fā)MM細胞中，TAK-981聯(lián)合Dex治療比單藥治療顯著增強了對MM細胞的殺傷力 （圖1C）。進一步的細胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)TAK-981與Dex在MM1S和MM1R細胞株中均有協(xié)同作用（圖1D）。Dex對MM1R細胞的誘導凋亡和抑制增殖作用有限。相比之下，TAK-981在兩種細胞系中誘導細胞凋亡并降低細胞活力，與Dex聯(lián)用后效果進一步增強（圖1E）。瞬時敲除SAE2、UBC9可顯著提高MM1R細胞Dex敏感性（圖1F）。穩(wěn)定敲除SAE2、UBC9的細胞對Dex處理均表現(xiàn)出顯著的反應，MM1R cells的IC50s值均下降（圖1G）。這些數(shù)據(jù)表明，SUMOylation與Dex抗性有關(guān)，抑制SUMOylation增強了Dex敏感性
圖1在原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤細胞和MM細胞系中，抑制SUMOylation與Dex協(xié)同降低細胞活力
2. TAK-981在體內(nèi)顯示出抗MM活性
通過構(gòu)建小鼠兩種異種移植模型，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，TAK-981治療組小鼠骨髓瘤負擔顯著降低（圖2A-B）。另外，與體外實驗一致，Dex單獨治療不影響腫瘤生長，而TAK-981與Dex聯(lián)合治療時，能顯著抑制腫瘤生長，進一步降低腫瘤負荷（圖3C）。免疫組化染色分析表明Dex單獨處理幾乎沒有誘導細胞凋亡，而TAK-981處理組明顯誘導cleaved PARP表達，Dex聯(lián)合處理后cleaved PARP表達水平更高（圖2D）。結(jié)果表明，TAK-981具有較強的體內(nèi)抗MM活性。
圖2 TAK 981在體內(nèi)抑制MM腫瘤生長并與Dex協(xié)同作用
3. 抑制SUMOylation通過下調(diào)miR-130b上調(diào)GR來提高Dex的敏感性
有報道稱GR的表達是Dex反應的主要機制，并與MM患者較好的預后有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)GR表達與原代MM細胞Dex IC50s值呈負相關(guān) （圖3A）?；?/span>SUMOylation抑制增強了Dex的敏感性，進而評估抑制SUMOylation對GR表達的影響：在TAK-981治療48小時后，劑量依賴性GR （NR3C1） mRNA上調(diào)（圖3B）。據(jù)報道，通過靶向3’-UTR下調(diào)GR mRNA水平的miR-130b，在相同的原代MM細胞中，經(jīng)TAK-981處理后顯示出劑量依賴性降低（圖3C）。在TAK-981處理的原代MM細胞中也誘導了GR蛋白水平（圖3D）。在MM1S和H929細胞系中觀察到類似的GR水平誘導和miR-130b降低（圖3E和F）。TAK-981降低了MM1S和H929細胞中RRM2水平，并進一步協(xié)同降低Dex對RRM2的降低。相應的誘導凋亡標志物cleaved PARP（圖3G），表明TAK-981對Dex細胞毒性的增強與GR regulated RRM2的抑制有關(guān)。SAE2水平較低（Sumoylization low）的患者GR抑制基因RRM2表達較低，GR激活基因RASD1水平較高。該分析支持了表明SUMO化抑制上調(diào)GR途徑。
圖3 TAK-981通過下調(diào)miR-130b上調(diào)原發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤和細胞系中GR的表達
4. 抑制SUMOylation通過調(diào)控miR-551b和miR-25提高了MM對Dex的敏感性
miR-mimic轉(zhuǎn)染后，過表達miR-551b和miR-25可促進MM細胞增殖并降低MM1S細胞的Dex敏感性，IC50s增加約4倍（圖4A-B）。miR抑制劑轉(zhuǎn)染miR-551b和miR-25后，miR-551b和miR-25的下調(diào)抑制了MM1R細胞的生長并增強了Dex敏感性，IC50s從875 μM下降到193和142 μM（圖4C-D）。這些數(shù)據(jù)表明，miR-551b和miR-25的表達可能與MM對Dex的耐藥有關(guān)。
由于PJA1和ZNF280C在MM細胞中沒有大量表達，因此ZFP36成為miR-551b的唯一潛在靶點。ZFP36編碼的tristtrprolin （TTP）是一種RNA結(jié)合蛋白，通過破壞Cyclin D1和E2F1 mRNA的穩(wěn)定性在癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用。通過轉(zhuǎn)染miR-551b inhibitor下調(diào)miR-551b水平，導致TTP水平升高，Cyclin D1和E2F1水平下降（圖4E）。ZFP36與miR-551b在初次MM樣本中的表達呈負相關(guān)（圖4F），進一步表明miR-551b調(diào)節(jié)ZFP36的水平。miR-25的下調(diào)顯著提高了ULK1的水平。敲低miR-25導致p27水平升高，這與MM初發(fā)樣本中p27 mRNA水平與miR-25呈負相關(guān)的觀察結(jié)果一致（圖4G-H）。
圖4 MiR-551b和MiR-25水平對MM Dex敏感性的影響
MM1R細胞的miR-551b和miR-25水平高于MM1S（圖5A）。Dex處理降低了MM1S中這兩種miRs的水平，但對MM1R沒有影響，而TAK-981處理降低了MM1S和MM1R細胞系中這兩種miRs的水平，并在與Dex聯(lián)合時進一步降低（圖5A）。通過siRNA瞬時轉(zhuǎn)染，SAE2或UBC9的下調(diào)降低了MM1R中miR-551b和miR-25的水平（圖5B）。另外，與細胞實驗結(jié)果一致，TAK-981治療組miR-551b和miR-25水平降低，并在MM1R異種移植瘤組織中聯(lián)合Dex治療后進一步降低（圖5C）。用不同濃度的TAK-981、miR-551b和miR-25處理5個原始MM樣本，其水平均呈劑量依賴性顯著降低，表明SUMOylation對miR-551b和miR-25的調(diào)控并不局限于細胞系（圖5D）。并且TAKU-981誘導miR-551b靶基因TTP表達，導致MM1R細胞Cyclin D1和E2F1降低，誘導miR-25靶基因ULK1和p27的表達（圖5E）。RNA-seq的GSEA分析顯示，TAKU-981影響細胞周期、凋亡和自噬基因集（圖5F），提示可能是通過這些基因靶向microRNAs- miR-551b和miR-25水平來達到作用。SAE2水平低的患者（UBA2；UBA2low組）的ZFP36（miR-551b靶基因）和ULK1（miR-25靶基因）水平高于SAE2水平高的患者（UBA2；UBA2high組）（圖5G）。該分析進一步支持了SUMOylation調(diào)控miR-551b, miR-25及其靶基因的表達。
圖5抑制SUMOylation降低miR-551b和miR-25水平
5. 抑制SUMOylation通過c-Myc降低miR-551b、miR-25和miR-130b的表達
在MM1S細胞中，c-Myc誘導的miR-551b、miR-25和miR-130b的pri-miR水平的增加可通過添加TAK-981處理來抑制（圖6A）。在MM1S細胞中siRNA轉(zhuǎn)染c-Myc （siMyc）導致pri-miRs和成熟miR水平顯著降低（圖6B）。在Dex誘導的c-Myc敲低后，pri-miRs和成熟miRs下降（圖6C）。TAK-981處理顯著降低了MM1S和MM1R細胞中這些miRs啟動子區(qū)域c-Myc結(jié)合的占用率（圖6D），證明SUMOylation通過c-Myc結(jié)合到啟動子區(qū)域來調(diào)節(jié)這些miRs的轉(zhuǎn)錄。Dex在MM1S細胞中對c-Myc的結(jié)合略有降低，而在MM1R細胞中對c-Myc的結(jié)合無影響，說明這些miRs參與了MM對Dex的敏感性。通過觀察15例復發(fā)患者原發(fā)MM細胞中c-Myc和SAE2水平與miR-551b、miR-25和miR-130b的表達之間的顯著正相關(guān)，qPCR進一步證實了miR-551b、miR-25和miR-130b對MM細胞c-Myc和SAE2的調(diào)控（圖6E-F）。這些都表明，SUMOylation通過介導c-Myc調(diào)控miR-551b、miR-25和miR-130b的表達。
圖6 c-Myc是miR-551b、miR-25和miR-130b的主要轉(zhuǎn)錄因子
6. 抑制SUMOylation降低了c-Myc水平
Dex降低了Dex敏感的MM1S細胞中的c-Myc蛋白，但對MM1R細胞沒有影響。然而，TAK-981處理顯示MM1S和MM1R細胞系中的c-Myc蛋白均減少，并且與Dex聯(lián)合使用時導致進一步減少（圖7A）。GSEA顯示TAK-981處理抑制了MM1S和MM1R細胞中Myc靶基因集，TAK-981和Dex聯(lián)合處理比單獨處理Dex更能抑制Myc靶基因集（圖7B）。并且TAK-981處理MM1R細胞后，c-Myc蛋白水平呈時間依賴性下降（圖7C）。與對照相比，TAK-981處理后的骨髓瘤細胞中c-Myc下降更快（圖7D），表明抑制SUMOylation通過增強c-Myc的降解而下調(diào)了c-Myc。另外，western blot結(jié)果顯示，TAK-981處理后，SUMOylation的c-Myc明顯減少（圖7E）。這些結(jié)果證明了c-Myc可通過直接SUMOylation進行調(diào)控。
圖7 抑制SUMOylation通過調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性降低了c-Myc蛋白水平
結(jié)論
該研究發(fā)現(xiàn)，SUMOylation抑制通過增加GR，降低miR-551b和miR-25，提高了MM對Dex的敏感性。SUMO E1抑制劑TAK-981大大提高了MM細胞系、原代樣本和小鼠異種移植模型對Dex的敏感性。TAK-981與Dex聯(lián)用具有明顯的體內(nèi)外協(xié)同抗MM作用。