TIGAR通過ROS/AMPK/SCD1途徑驅動結直腸癌鐵死亡抗性

結直腸癌（CRC）是世界上第三常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因。鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種調節(jié)性細胞死亡。越來越多的證據表明，鐵死亡在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調節(jié)作用。本研究確定TIGAR是CRC發(fā)展過程中抗鐵死亡的潛在調節(jié)因子。我們發(fā)現(xiàn)TIGAR在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。TIGAR敲除顯著增加了erastin誘導的SW620和HCT116細胞鐵死亡。值得注意的是，TIGAR敲除顯著降低了GSH/GSSG比率，增加了脂質過氧化的產生，促進了脂質過氧化產物丙二醛（MDA）的積累，并使CRC細胞對erastin誘導的鐵死亡更加敏感。此外，TIGAR抑制以氧化還原和AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達。因此，這些結果表明TIGAR通過ROS/AMPK/SCD1信號通路誘導結腸癌細胞的鐵死亡抗性。本文于2022年3月發(fā)表于“Free Radical Biology And Medicine”（IF= 7.376）上。

技術路線

結果

1）TIGAR在結腸癌中高表達

我們首先分析了TIGAR在不同細胞和非腫瘤組織中的表達模式。應用TNMplot分析TIGAR在不同腫瘤類型TCGA中的表達狀態(tài)。如圖1A所示，TIGAR在乳腺、結腸、肝臟、肺、胃、前列腺、皮膚、腎臟等腫瘤組織中的表達水平高于相應的鄰近正常組織。接下來，從TCGA數據庫中研究TIGAR在結腸癌組織中的表達。如圖1B所示，未配對和配對分析均表明，與相鄰正常組相比，結腸癌腫瘤組織中TIGAR mRNA表達上調，以及TCGA數據庫中各個癌癥階段的TIGAR mRNA表達上調。UALCAN的CPTAC數據集的結果顯示，結腸癌原發(fā)組織中TIGAR總蛋白的表達高于癌旁正常組織（圖1B）。此外，我們還檢測了一組結腸癌細胞中TIGAR的mRNA和蛋白。與正常結直腸細胞系NCM460相比，SW620、HCT116和DLD1細胞中TIGAR mRNA和蛋白質表達上調（圖1C和D）?？傊?span style="background: yellow;">這些數據表明TIGAR在CRC的進展中起著關鍵作用。

2）鐵死亡與CRC的發(fā)展有關

我們研究了478例COAD患者TIGAR的生物學功能?；蚣患治觯?/span>GSEA）表明，許多與TIGAR相關的基因位于鐵死亡、氧化磷酸化和脂肪酸代謝中（NES>1.8, FDR<0.05）。（圖2A）。在這項研究中，我們分析了在結腸癌組織和正常鄰近組織中調節(jié)鐵死亡的關鍵基因的差異表達。結果表明，TCGA數據庫中22個基因在結腸癌組織和正常癌旁組織中的表達存在顯著差異。熱圖分析結果顯示，LPCAT3、ACO1、IREB2、NCOA4和HMOX1在結腸癌細胞中下調（圖2B）。而SLC3A2和GPX4在結腸癌細胞中上調（圖2B）。此外，我們在TCGA數據庫中使用UALCAN對鐵死亡的關鍵基因進行分類，并分析其在CRC組織和正常相鄰組織中的表達情況。結果顯示，與正常鄰近組織相比，CRC組織中SLC7A11、GPX4、ACSL4、TFRC和SLC11A2表達上調，而HMOX1、LPCAT3、ALOX12和SLC40A1表達下調(圖2C)。所有這些都表明，很多與鐵死亡相關的基因在結腸癌組織中異常表達。

3）鐵死亡誘導劑erastin對結腸癌細胞活力的影響

為了確定erastin在結腸癌細胞活力中的作用，我們首先在五種結腸癌細胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和SW620中測量了erastin對細胞活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)erastin以劑量相關的方式抑制細胞增殖（圖3A）。為了進一步證實erastin對結腸癌細胞活力的影響，選擇2μM erastin處理不同的結腸癌細胞。HT29和SW480對2μM erastin處理的erastin誘導的鐵死亡高度敏感；DLD1、HCT116和SW620對經2μM erastin處理的鐵死亡具有抵抗力（圖3B）。由于SW620和HCT116細胞在所測試的CRC細胞系中具有最高水平的TIGAR，因此在以下實驗中選擇了HCT116和SW620細胞。這些數據表明TIGAR可能與HCT116和SW620細胞的鐵死亡抗性有關。

4）TIGAR敲除增強erastin誘導的SW620和HCT116細胞死亡

盡管TIGAR在氧化還原和代謝調節(jié)中起著重要作用，但對于TIGAR在結腸癌細胞中的抗鐵死亡性知之甚少。為了探討TIGAR對結腸癌細胞鐵死亡的影響，在HCT116和SW620細胞中用shRNA#1和#2敲除TIGAR。RT-qPCR和western blot證實，在HCT116和SW620細胞中，TIGAR的mRNA（圖4A）和蛋白質（圖4B）表達顯著下調。為了研究TIGAR在結腸癌細胞鐵死亡中的作用，用MTS法和細胞死亡法對HCT116和SW620細胞的細胞活力和細胞死亡進行了評估。HCT116和SW620細胞用鐵死亡誘導劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin-1處理24小時。如圖4C所示，TIGAR的敲除顯著增加了erastin誘導的生長抑制，這種效應可通過HCT116和SW620細胞中的ferrostatin-1逆轉。類似地，erastin治療增加了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡，ferrostatin-1治療逆轉了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡水平（圖4D）。這些結果表明，TIGAR敲除增加了HCT116和SW620細胞對鐵死亡的敏感性，TIGAR是鐵死亡的潛在負調節(jié)因子。

5）TIGAR敲除促進HCT116和SW620細胞的鐵死亡

脂質過氧化和鐵積累是鐵死亡的兩個主要生化特征。C11-BODIPY染色流式細胞術檢測脂質過氧化。如圖5A所示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著降低了經erastin處理的HCT116和SW620細胞中的GSH/GSSG比率。此外，我們還進一步研究了TIGAR敲除對脂質過氧化和脂質過氧化終產物丙二醛（MDA）的影響。結果顯示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著增加了HCT116和SW620細胞的脂質過氧化和MDA水平（圖5B和C）。有趣的是，在TIGAR敲除細胞中，鐵的相對水平沒有明顯變化（圖5D）。結果提示TIGAR敲除可誘導結腸癌細胞鐵死亡。

6）TIGAR敲除以ROS/AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達

AMPK是細胞能量水平的關鍵傳感器，協(xié)調多種代謝途徑以維持能量平衡，包括脂質代謝。為了進一步確定TIGAR在脂質過氧化中的作用機制，我們研究了TIGAR對AMPK信號通路的影響。如圖6A所示，在HCT116和SW620細胞中，TIGAR的敲除顯著誘導AMPK的激活和SCD1表達的下調。為了了解AMPK信號通路的潛在作用，將AMPK抑制劑化合物C用于HCT116和SW620細胞。TIGAR敲除導致SCD1蛋白表達降低，而SCD1的蛋白表達隨著化合物C的處理而增加（圖6B）?；衔?/span>C的處理顯著增加了TIGAR敲除HCT116和SW620細胞的細胞活力（圖6C）。這些結果表明，敲除TIGAR可以以AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達，從而促進鐵死亡。

7）TIGAR敲除以氧化還原依賴的方式抑制SCD1的表達

在以前的研究中，TIGAR顯示出強大的抗氧化作用，并顯著降低細胞內的ROS水平。用DCFH-DA和DHR123流式細胞術觀察活性氧。在erastin治療后，TIGAR敲除增加了ROS水平（圖7A）。為了進一步證明TIGAR通過活性氧影響鐵死亡，我們在HCT116和SW620細胞中添加了抗氧化劑NAC。在HCT116和SW620細胞中，TIGAR敲除導致SCD1的減少和p-AMPK蛋白表達的增加，而NAC處理使SCD1的蛋白表達增加，p-AMPK的蛋白表達降低（圖7B）。NAC治療顯著降低了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡（圖7C）。這些結果表明TIGAR通過ROS/AMPK調節(jié)增強了結腸癌細胞對鐵死亡的抵抗力。

結論：我們的工作揭示了TIGAR抑制結腸癌細胞鐵死亡的調節(jié)機制。結腸癌細胞中TIGAR的缺失通過增加ROS產生和促進ROS/AMPK介導的SCD1下調表達促進脂質過氧化。因此，靶向TIGAR可能是一種潛在的基于鐵死亡的結腸癌的治療方法。

參考文獻：

Liu MY, Li HM, Wang XY, Xia R, Li X, Ma YJ, Wang M, Zhang HS. TIGAR drives colorectal cancer ferroptosis resistance through ROS/AMPK/SCD1 pathway. Free Radic Biol Med. 2022 Mar 7;182:219-231. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2022.03.002.