S6K1介導的PDK1磷酸化受損削弱AKT激酶活性和致癌作用

蛋白質激酶作為細胞信號轉導的中心節(jié)點，在時間和空間上能使下游底物發(fā)生磷酸化，以催化傳遞來自細胞外或細胞內變化的信號。3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶1 (PDK1)作為一種主激酶，在磷酸化和激活蛋白激酶A、B和C (AGC)家族激酶(包括AKT)中起著重要作用，但目前對PDK1的上游調控作用少有報道。本研究報道了核糖體蛋白S6激酶β1 (S6K1)直接磷酸化蛋白同源結構域，并破壞PDK1與AKT的相互作用和活化。本文于2022年3月發(fā)表于 《Nature Communications》，IF=14.919。

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本文主要內容：

1 S6K1直接磷酸化PDK1的Ser549位點

作者推測上游激酶可能介導PDK1-S549磷酸化，于是分析S549周圍氨基酸情況，發(fā)現(xiàn)S549位點內存在一個經典的AGC激酶磷酸化共識基序位點(RxRxxS/T) (Fig 1a)。為了評估AGC激酶家族是否可以促進PDK1在該位點的磷酸化，篩選了一組AGC激酶，包括AKT1 (myr-AKT1)，AKT2 (myr-AKT2)，S6K1 (S6K1- r3a)和SGK1 (SGK1-Δ60)。用內源性的AKT底物磷酸化抗體檢測到S6K1，而不是其他的AGC激酶在內源性水平上顯著增強PDK1磷酸化(Fig 1b)。胰島素誘導的PDK1磷酸化可被mTORC1或S6K抑制劑顯著拮抗，AKT抑制劑的拮抗程度較低，同時S6K下游底物核糖體蛋白S6的磷酸化事件減少(Fig 1c)。與此一致的是，S6K1可以顯著增強PDK1的磷酸化，且呈劑量依賴性(Fig 1d)，而S6K1誘導的PDK1磷酸化可被mTORC1或S6K抑制劑減弱 (Fig 1e)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)PDK1磷酸化隨胰島素刺激而波動。此外，胰島素在S6K1和S6K2雙敲除(S6K1 /2?/?)小鼠胚胎的成纖維細胞(mef)中極大促進了PDK1磷酸化(Fig 1f)。提示S6K1在胰島素誘導中可能是必需的基因磷酸化。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，癌細胞中S6K1的缺失顯著減少了PDK1的磷酸化 (Fig 1g)。

為了驗證S549是否確實是PDK1上主要的S6K1磷酸化殘基，作者發(fā)現(xiàn)S549A敲除降低了S6K1介導的PDK1磷酸化 (Fig 1h)。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，在體外S6K1可以直接磷酸化WT突變體，而不能磷酸化S549A突變體 (Fig 1i)。為了進一步檢測S549位點的PDK1磷酸化，作者構建并驗證了磷酸化抗體特異性識別的PDK1-pS549，并觀察到S6K1確實可以在細胞的S549位點磷酸化PDK1 (Fig 1b-h)，也能被mTORC1或S6K抑制劑可以抑制 (Fig 1c)。這些結果表明S6K1能直接磷酸化PDK1的Ser549殘基。

Fig1  S6K直接使PDK1在Ser549位點磷酸化

2 S6K1介導的PDK1磷酸化抑制AKT激酶活性和致癌功能

為了探究S6K1介導的PDK1磷酸化的生物學功能，作者將PDK1的不同突變形式(WT、S549A和S549D)引入DLD1-PDK1^?/?細胞中，發(fā)現(xiàn)與WT或PDK1-S549D相比、PDK1-S549A表達顯著升高AKT-pT308 (Fig 2a)。此外，在胰島素處理條件下，如pGSK3β，與表達PDK1-WT-或S549D的細胞相比，DLD1-PDK1?/?表達PDK1-S549A的細胞中pT308-AKT及其下游底物顯著升高(Fig 2b，c)。

作者發(fā)現(xiàn)，與WT或S549D突變體PDK1相比，引入缺磷型PDK1 (S549A)可以顯著促進細胞集落形成和錨定獨立生長 (Fig 2d，e)。為了揭示PDK1-S549磷酸化在體內對腫瘤生長的作用，作者利用異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與表達細胞S549的DLD1-PDK1?/?的細胞相比，PDK1-S549A的表達明顯促進DLD1-PDK1?/?細胞腫瘤的生長 (Fig 2f–j)。同時，與PDK1-WT或S549D的表達的腫瘤相比較，攜帶PDK1-S549A的腫瘤表現(xiàn)出更多的Ki67染色，同時AKT下游底物pS6增加 (Fig 2k，l）。這些結果表明，在體內和體外，S6K介導的PDK1磷酸化負調控AKT激酶活性和致癌功能。

Fig2 PDK1的磷酸化抑制AKT激酶的活性和致癌功能

3 PDK1- S549磷酸化顯著減弱PDK1與PIP3的相互作用和質膜定位

為了研究S6K1介導的PDK1磷酸化是否影響其激酶活性，作者對PDK1進行了體外激酶測定。結果表明，S6K1-R3A的組成活性形式與PDK1- wt、S549A或S549D變體僅輕度影響PDK1磷酸化其底物AKT1的能力 (Fig 3a)，表明S6K1介導的PDK1磷酸化對AKT激酶活性的抑制可能不是由于PDK1酶活性降低所致。接下來，作者發(fā)現(xiàn)PDK1和S6K1-R3A可顯著降低PDK1與AKT的相互作用，且呈劑量依賴性，且S549處PDK1的磷酸化水平增加 (Fig 3b)。通過磷酸化IRS1/2來排除S6K已建立的負反饋作用的影響，觀察PDK1-S549D或S549A與AKT之間的互作，結果發(fā)現(xiàn)PDK1-S549A的相互作用增強，而S549D減弱，但不影響與其他PDK1底物(如SGK1、PLK1或S6K1)的相互作用 (Fig 3c)。

已有研究表明PDK1和AKT的相互作用主要發(fā)生在PIP3定位的質膜上，PIP3的pull-down檢測結果顯示，S6K1-R3A顯著降低了WT的相互作用，而PDK1的S549A突變體與PIP3的相互作用沒有降低(Fig 3d)。同時，抑制S6K1活性可以促進PDK1與PIP3的相互作用(Fig 3e)。這些數(shù)據(jù)表明，S549磷酸化可以使PDK1從質膜和PIP3中分離出來，從而降低PDK1與AKT的相互作用。與這一發(fā)現(xiàn)一致，作者觀察到S6K1確實可以通過細胞分餾分析降低PDK1的膜定位或免疫染色 (Fig 3g)。因此，與WT或S549D形式的PDK1相比，S549A突變體增強了PDK1膜定位。

Fig 3 S6K1介導的PDK1磷酸化抑制PDK1膜定位和PIP3結合

4、14-3-3介導PDK1從PIP3中分離，并促進其二聚

為了揭示磷酸化PDK1與PIP3解離并形成二聚體的潛在機制，作者假設存在能夠識別磷酸化PDK1的接頭蛋白，并進一步干擾其與PIP3的相互作用。已有研究證實14-3-3接頭蛋白在蛋白室轉位中起主要作用，尤其是磷酸化蛋白。因此，作者對14-3-3家族成員進行了篩選，發(fā)現(xiàn)14-3-3γ可以在外源和內源水平上特異性地與PDK1相互作用 (Fig 4a–c)。值得注意的是，RxxpSxP這個基序與S6K1介導的PDK1磷酸化殘基(Ser549)重疊，并且在不同物種之間進化保守 (Fig 4d)。有趣的是，與PDK1、AKT1、PLK1和SIN1衍生的不同PH結構域相比，作者觀察到只有PDK1-PH參與14-3-3γ的結合。更重要的是，S6K1- r3a顯著增強，而S6K1的消耗減少了PDK1與14-3-3γ之間的互作 (Fig 4g)。在細胞和體外實驗中，S549D突變體PDK1增強，而S549A突變體PDK1減弱PDK1與14-3-3γ的相互作用 (Fig 4e,f)。

先前有報道稱，磷酸化絲氨酸或蘇氨酸后的脯氨酸殘基對14-3-3相互作用至關重要。因此，無論在細胞內還是體外，PDK1- p551a突變均能強烈減弱PDK1與14-3-3γ的相互作用。然而，P551A突變體并沒有消除S6K介導的PDK1與PIP3的分離 (Fig 4g)，從而增加了AKT的相互作用，這不能被異位表達S6K1-R3A破壞(Fig 4g)。 S6K1-R3A或PDK1- S549d的異位表達同樣增強了14-3-3γ向PDK1的招募(Fig 4g)。此外，P551A突變體增強了其與PIP3的結合，S6K1-R3A的表達不會干擾PIP3的結合(Fig 4i)。

通過凝膠過濾的方法，作者觀察到PDK1和pS549-PDK1在其二聚體大小在150KD左右時，與14-3-3γ共聚在相似的部分(Fig 4j)，表明14-3-3γ可能是磷酸化PDK1進行二聚反應。此外，消耗14-3-3γ會破壞PDK1的二聚反應(Fig 4k)，并增加PDK1與AKT的相互作用。更重要的是，14-3-3γ敲除顯著提高了AKT及其下游靶點磷酸化水平(Fig 4l,m)。表明接頭蛋白14-3-3γ在S6K1介導的AKT被PDK1抑制過程中起重要作用。這些研究結果表明，14-3-3γ以S6K1介導的S549磷酸化依賴的方式與PDK1結合，使PDK1與PIP3分離，進而促進PDK1二聚化，從而抑制AKT激酶活性(Fig 4n)。

Fig4 14-3-3γ結合磷酸化的PDK1并將其從細胞質膜上解離

5．患者相關的PDK1突變削弱其與14-3-3的相互作用，促進AKT激酶活性和致癌功能

為探討S6K1介導PDK1磷酸化在腫瘤發(fā)生中的病理作用，對癌癥基因組數(shù)據(jù)進行分析，結果發(fā)現(xiàn)患者相關的PDK1突變發(fā)生在S6K1介導的PDK1磷酸化或14-3-3γ結合區(qū)域附近 (Fig 5a)。

接下來，這些突變被分成兩組，I型突變位于可能阻斷S6K1介導的磷酸化的區(qū)域; (R544K， R546P和S549N)；II型突變(P551A， P551L和P551Q)可能在直接干擾對14-3-3γ的識別(Fig 5a)。結果發(fā)現(xiàn)， I型突變以及程度較輕II型突變，顯著降低了S6K1介導的PDK1磷酸化(Fig 5b）。I型和II突變體顯著減弱PDK1/14-3-3γ相互作用(Fig 5c），從而增加了PDK1與PIP3的結合 (Fig 5d），以及它們的膜定位(Fig 5e–h)。值得注意的是，這些突變增強了PDK1與AKT的相互作用(Fig 5i,j)，同時增加了HEK293-sgPDK1細胞中AKT及其靶蛋白的磷酸化水平 (Fig 5k,l)。

Fig5 患者相關的PDK1突變與PDK1膜位置和AKT激酶激活有關

此外，將這些變量重新引入DLD1-PDK1^?/?或SW480-shP DK1細胞中增加了pT308-AKT的表達 (Fig 6a)，并促進了癌細胞的致癌能力(Fig 6b,c)。此外，與表達WT-PDK1的細胞相比，這些突變體還促進了異種移植小鼠模型中腫瘤的生長，并增加了AKT下游的pS6，以及增殖標志物Ki67的表達（Fig 6d–g）。

Fig 6患者來源的PDK1突變促進AKT1的激活和致癌功能

總之，S6K1直接磷酸化PDK1的PH結構域，增強PDK1結合14-3-3的能力，進而解離PIP3和質膜中的PDK1，導致PDK1/AKT相互作用減少，AKTT308磷酸化受損。這一觀察結果表明，S6K1以不同的負反饋方式和磷酸化依賴方式緊密控制AKT激酶的活性（Fig 7）。

Fig 7 生理和病理條件下S6K1對PDK1負調控的模型

參考文獻：

Jiang, Q., et al., S6K1-mediated phosphorylation of PDK1 impairs AKT kinase activity and oncogenic functions. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1548.