在16q22.1位點(diǎn)的增強(qiáng)子變體通過(guò)調(diào)節(jié)PRMT7的表達(dá)使其更易發(fā)生肝細(xì)胞癌

大多數(shù)癌癥的致病變異是在基因調(diào)控元件中發(fā)現(xiàn)的，例如增強(qiáng)子。然而，易導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(HCC)的增強(qiáng)子變異仍未被報(bào)道。本研究中對(duì)HCC增強(qiáng)子進(jìn)行篩選并研究其分子機(jī)制，本研究于2022年4月發(fā)表于《Nature communicate》， IF=12.121。

本文技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1.  增強(qiáng)區(qū)SNP rs73613962與HCC風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)

為了獲取存在于增強(qiáng)子中的HCC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)SNPs，篩選出總計(jì)4898個(gè)HCC SNPs和7060例非HCC對(duì)照，并對(duì)其中的6個(gè)候選SNPs進(jìn)行驗(yàn)證 (Fig. 1a)。在第1個(gè)復(fù)制階段，這6個(gè)篩選的候選SNPs都被評(píng)估為與HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)，其中只有rs73613962位于PRMT7的16q22.1位點(diǎn)的內(nèi)含子區(qū)域 (Fig. 1b)。在第2個(gè)復(fù)制階段， rs73613962被一致證實(shí)與HCC風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，rs73613962在GWAS顯著水平上被確定為一個(gè)HCC易感位點(diǎn) (Fig. 1C)。

Fig1 篩選并驗(yàn)證了候選增強(qiáng)子變體rs73613962與HCC風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)

2.  含有rs73613962的區(qū)域具有等位基因特異性增強(qiáng)子活性

在HepG2細(xì)胞中，rs73613962位點(diǎn)附近的H3K4me1和H3K27ac明顯的表觀遺傳信號(hào)驗(yàn)證了rs73613962位點(diǎn)包含增強(qiáng)子活性的存在(Fig. 2a)。高信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和rs73613962附近的DNase簇可能增強(qiáng)了增強(qiáng)子活性(Fig. 2a)。

為了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證含有rs73613962的增強(qiáng)子活性，作者進(jìn)行了增強(qiáng)子雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中，以rs73613962為中心的DNA序列在正向和反向方向均顯示出高于對(duì)照序列的熒光素酶活性 (Fig. 2b–g）。接下來(lái)，作者研究了rs73613962是否會(huì)影響增強(qiáng)子的活性。結(jié)果表明，在這些HCC細(xì)胞系中，具有危險(xiǎn)等位基因G的序列與具有非危險(xiǎn)等位基因T的序列相比，具有顯著的熒光素酶活性 (Fig. 2b-g)，提示該區(qū)域可能是一個(gè)具有等位基因特異性活性的增強(qiáng)子。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明含有HCC易感基因rs73613962的PRMT7內(nèi)含子區(qū)域具有等位基因特異性增強(qiáng)子活性，而rs73613962的風(fēng)險(xiǎn)等位基因G相對(duì)于非風(fēng)險(xiǎn)等位基因T具有更高的增強(qiáng)子活性。

Fig2含有rs73613962的區(qū)域具有增強(qiáng)子信號(hào)和等位基因特異性增強(qiáng)子活性

3.  增強(qiáng)子變體rs73613962調(diào)節(jié)PRMT7的表達(dá)

為了探究rs73613962是否與其附近基因的表達(dá)相關(guān)，肝臟組織進(jìn)行了cis-eQTL分析，發(fā)現(xiàn)rs73613962僅與PRMT7的表達(dá)水平顯著相關(guān) (Fig 3a)。有趣的是，PRMT7是rs73613962的宿主基因，這表明該內(nèi)含子增強(qiáng)子可能直接調(diào)控PRMT7的轉(zhuǎn)錄。此外，rs73613962的風(fēng)險(xiǎn)等位基因G被發(fā)現(xiàn)與PRMT7表達(dá)增加密切相關(guān)，與上述熒光素酶檢測(cè)結(jié)果一致。通過(guò)分析rs73613962基因型和rs73613962的表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)所有的肝細(xì)胞癌(LIHC)受試者、TCGA腫瘤和癌癥基因中表達(dá)模式相同 (Fig 3b）。

為研究包含rs73613962的區(qū)域是否在CRISPR-Cas9， dCAS9-KRAB順式突變、抑制和激活PRMT7表達(dá)中起因果作用，利用CRISPR-Cas9對(duì)rs73613962周?chē)鷧^(qū)域進(jìn)行基因編輯。在CRISPR-Cas9實(shí)驗(yàn)中，作者選擇了rs73613962位點(diǎn)三個(gè)不同突變的單克隆和該區(qū)域兩個(gè)無(wú)突變的克隆進(jìn)行后續(xù)調(diào)查。如圖3c所示，與兩個(gè)對(duì)照相比，在三個(gè)突變的克隆中，PRMT7的表達(dá)量明顯下降，這表明PRMT7的表達(dá)受rs73613962的直接調(diào)控（Fig 3C），與此結(jié)果一致的是，CRISPRi檢測(cè)結(jié)果顯示，在QGY-7703和HepG2細(xì)胞系中，當(dāng)sgRNAs靶向rs73613962的上下游序列時(shí)，從QGY-7703和HepG2細(xì)胞系中PRMT7的表達(dá)均降低，說(shuō)明包含rs73613962的增強(qiáng)子活性可能減弱， (Fig. 3d–f）。在CRISPRa試驗(yàn)中，作者檢測(cè)到PRMT7 mRNA水平和蛋白水平在QGY-7703和HepG2細(xì)胞系中均顯著升高(Fig. 3g–i)。表明該區(qū)域的增強(qiáng)子活性可能通過(guò)dCAS9-融合轉(zhuǎn)錄激活域VP48增強(qiáng)。

Fig 3 rs73613962通過(guò)調(diào)節(jié)增強(qiáng)子活性來(lái)調(diào)節(jié)PRMT7的表達(dá)

4.  rs73613962的風(fēng)險(xiǎn)等位基因G提高了HNF4A基因的結(jié)合能力

在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中觀察到，等位基因G的寡核苷酸對(duì)核提取物的競(jìng)爭(zhēng)能力高于等位基因T的寡核苷酸 (Fig. 4a）。

作者首先通過(guò)對(duì)含有rs73613962的增強(qiáng)子序列進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，確定了HNF4A是否能與駐留在rs73613962的增強(qiáng)子結(jié)合。如圖4b所示，當(dāng)HNF4A特異性抗體與對(duì)照抗體免疫球蛋白G相比較時(shí)，通過(guò)ChIP與定量聚合酶鏈反應(yīng)(ChIPqPCR)在QGY-7703細(xì)胞株中檢測(cè)到HNF4A結(jié)合在該區(qū)域的強(qiáng)富集。此外，ChIP-PCR也證實(shí)了HNF4A與QGY-7703和HepG2細(xì)胞株中含有rs73613962增強(qiáng)子區(qū)域的結(jié)合(Fig. 4c)。

隨著HNF4A與等位基因G的結(jié)合增多，HNF4A基因的敲除預(yù)計(jì)會(huì)對(duì)含等位基因G的增強(qiáng)子活性產(chǎn)生更大的影響。利用增強(qiáng)子雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)siRNA下調(diào)HNF4A時(shí)，含有等位基因G的增強(qiáng)子的熒光素酶活性顯著降低。相比之下，含有等位基因的增強(qiáng)子的熒光素酶活性在HNF4A基因敲除后幾乎沒(méi)有變化(Fig. 4d)。此外，在核提取物中加入anti-HNF4A后，兩種肝癌細(xì)胞系中HNF4A與含等位基因G的序列的結(jié)合消失了(Fig. 4e)。

由于rs73613962與PRMT7的表達(dá)有關(guān)，作者推測(cè)，如果rs73613962相關(guān)增強(qiáng)子結(jié)合需要該轉(zhuǎn)錄因子，則下調(diào)該轉(zhuǎn)錄因子將降低靶基因PRMT7的表達(dá)。作者在QGY-7703和HepG2細(xì)胞系中敲除了HNF4A，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞中PRMT7的表達(dá)下降 (Fig. 4f)。此外，作者發(fā)現(xiàn)PRMT7 RNA水平與HNF4A的表達(dá)呈正相關(guān) (Fig. 4g）。有趣的是，攜帶G等位基因的受試者比攜帶TT純合子的受試者具有更高的相關(guān)性 (Fig. 4h，i)。

Fig 4.：rs73613962的風(fēng)險(xiǎn)等位基因G增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子HNF4A的結(jié)合能力，促進(jìn)PRMT7的表達(dá)

5.  PRMT7促進(jìn)癌癥相關(guān)表型

作者發(fā)現(xiàn)目的基因PRMT7內(nèi)含子內(nèi)的HCC風(fēng)險(xiǎn)等位基因rs73613962 G增強(qiáng)了HNF4A的結(jié)合，而HNF4A反過(guò)來(lái)促進(jìn)了PRMT7的表達(dá)。因此，作者想知道PRMT7的高表達(dá)是否有助于癌癥相關(guān)的細(xì)胞表型，從而導(dǎo)致高HCC風(fēng)險(xiǎn)。在QGY-7703細(xì)胞中，用兩個(gè)短發(fā)夾敲低PRMT7 RNAs均降低了QGY-細(xì)胞的增殖速率(Fig. 5a，b)。PRMT7-下調(diào)的細(xì)胞集落形成能力也低于對(duì)照組細(xì)胞(Fig. 5c)。此外，細(xì)胞耗盡與對(duì)照細(xì)胞相比，PRMT7表達(dá)明顯阻滯G1期，顯著降低S期(Fig. 5d)。此外，在HCC細(xì)胞株QGY-7703中，敲除PRMT7可顯著降低細(xì)胞遷移和侵襲能力(Fig. 5e，f)。

體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，PRMT7下調(diào)可降低異種移植瘤的生長(zhǎng)(Fig. 5g–i)。通過(guò)免疫組化(IHC)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，yu與癌旁組織相比，PRMT7在HCC組織中表達(dá)更高 (Fig. 5j，k)。此外，在TCGA LIHC中，腫瘤組織中PRMT7的表達(dá)高于正常組織(Fig. 5l)。

綜上所述， PRMT7的表達(dá)由含有rs73613962的內(nèi)含子調(diào)控的，可以解釋rs73613962和HCC風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，至少在一定程度上是這樣的。

Fig 5. PRMT7下調(diào)降低了癌癥相關(guān)表型，而在HCC腫瘤中PRMT7上調(diào)

6.  PRMT7通過(guò)H4R3me2s修飾調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，作者發(fā)現(xiàn)在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用的p53信號(hào)通路排在前1位，暗示這些在該通路中富集的基因可能參與了prmt7介導(dǎo)的HCC發(fā)展(Fig 6a，b)。作者通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證了CDKN1A、GADD45B、FAS、PMAIP1等基因?qū)儆?/span>p53信號(hào)通路 (Fig. 6c)。

據(jù)報(bào)道，PRMT7介導(dǎo)的組蛋白4的精氨酸上的單甲基精氨酸(MMA)可催化建立抑制性組蛋白標(biāo)記。作者通過(guò)Western blot檢測(cè)了H4R3me2s修飾對(duì)prmt7下調(diào)的細(xì)胞和對(duì)照組的信號(hào)。

作者通過(guò)WB檢測(cè)了PRMT7下調(diào)細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞中H4R3me2s修飾的信號(hào)。檢測(cè)到H4R3me2s信號(hào)顯著降低，但與對(duì)照組相比，PRMT7耗盡樣品的H4沒(méi)有明顯變化 (Fig. 6d),表明PRMT7對(duì)H4R3me2s修飾基因的調(diào)控。    CAGCTG基序是H4R3me2s 結(jié)合區(qū)顯著富集的序列，因此，作者掃描這些富集于p53信號(hào)通路的核心啟動(dòng)子基因，以獲取CAGCTG motif的分布。，作者通過(guò)RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)PRMT7下調(diào)細(xì)胞中上調(diào)的4個(gè)基因進(jìn)行了研究，并通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖6e-h，我們發(fā)現(xiàn)p53信號(hào)通路中富集的基因H4R3me2s修飾區(qū)包括CAGCTG基序。

因此，這些結(jié)果綜合提示富集于p53信號(hào)通路的基因，其H4R3me2s修飾受PRMT7調(diào)控，可能參與了PRMT7介導(dǎo)的癌癥相關(guān)表型。

Fig. 6在HCC細(xì)胞中p53信號(hào)通路受PRMT7調(diào)控

在PRMT7的一個(gè)內(nèi)含子增強(qiáng)區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)肝癌易感SNP rs73613962，并證實(shí)了其在癌癥相關(guān)表型中的因果作用。轉(zhuǎn)錄因子HNF4A被發(fā)現(xiàn)與含有rs73613962的增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)宿主基因PRMT7的表達(dá)，最終參與了HCC的發(fā)病機(jī)制。這一研究成果可能有助于闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，并對(duì)肝癌的預(yù)防和治療具有潛在的意義。

參考文獻(xiàn)：
 Shen, T., et al., An enhancer variant at 16q22.1 predisposes to hepatocellular carcinoma via regulating PRMT7 expression. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1232.