FSTL1促進(jìn)肝纖維化

FSTL1被廣泛認(rèn)為是一種分泌糖蛋白，但其在肝纖維化過程中調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥的作用尚未被證實(shí)。在此，我們的目標(biāo)是描述巨噬細(xì)胞FSTL1在肝纖維化發(fā)展中的作用。人和小鼠纖維化肝臟巨噬細(xì)胞中FSTL1的表達(dá)均顯著升高。骨髓特異性FSTL1缺失可有效減緩肝纖維化的進(jìn)展。在FSTL1^{M- KO}小鼠中，肝纖維化過程中形成的微環(huán)境炎癥反應(yīng)相對(duì)較少。在體內(nèi)和體外，FSTL1^{M- KO}巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M1極化抑制和NF-κB通路激活的抑制。此外，本研究還表明，FSTL1通過其FK結(jié)構(gòu)域直接與PKM2結(jié)合。有趣的是，FSTL1促進(jìn)PKM2磷酸化和核易位，減少PKM2泛素化以增強(qiáng)PKM2依賴的糖酵解，增加M1極化。PKM2的藥理激活部分緩解了FSTL1介導(dǎo)的糖酵解和炎癥反應(yīng)。本文于2022年1月發(fā)表于Gut（IF=23.059）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）FSTL1在纖維化肝組織的巨噬細(xì)胞中表達(dá)增加

首先，我們的目標(biāo)是研究FSTL1在纖維化肝臟樣本中的表達(dá)特征。我們收集了51個(gè)人類肝臟樣本，包括正常和纖維化的肝臟組織。與正常對(duì)照肝臟相比，FSTL1的mRNA和蛋白表達(dá)在纖維化肝臟中顯著升高(圖1A,B)。接下來，我們確定FSTL1的表達(dá)是否主要在肝巨噬細(xì)胞中升高。雙免疫熒光染色顯示，FSTL1主要表達(dá)于人纖維化肝臟中的巨噬細(xì)胞上(圖1C)。通過重新分析一個(gè)已發(fā)布的數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)FSTL1在HCV誘導(dǎo)或NASH誘導(dǎo)的肝纖維化中表達(dá)顯著升高(圖1D)。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，我們?cè)谌N廣泛認(rèn)可的肝纖維化動(dòng)物模型中探索了FSTL1的表達(dá)，即CCl4注射誘導(dǎo)、BDL誘導(dǎo)和MCD飲食誘導(dǎo)的肝纖維化。所有模型肝組織中FSTL1的表達(dá)均顯著升高(圖1E,F)。然后，我們從纖維化的小鼠肝臟中分離出肝巨噬細(xì)胞。一致地，從纖維化肝臟分離的巨噬細(xì)胞中FSTL1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(圖1G)。雙免疫熒光染色進(jìn)一步顯示FSTL1+CD68+巨噬細(xì)胞在纖維化肝臟中明顯多于對(duì)照組(圖1H)。綜上所述，FSTL1在肝組織中表達(dá)顯著增加，尤其是在纖維化肝的巨噬細(xì)胞中。

2）髓系FSTL1缺乏可減輕肝纖維化

為了檢測(cè)FSTL1+巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的功能，我們使用Cre-LoxP系統(tǒng)創(chuàng)建骨髓特異性FSTL1-deficient (FSTL1^M-KO)小鼠。然后用CCl4注射、BDL或MCD飲食誘導(dǎo)FSTL1^FL/FL和FSTL1^{M- KO}小鼠肝纖維化。圖2A顯示，Masson 's、Sirius Red和α-SMA染色顯示，FSTL1^M-KO小鼠的肝纖維化明顯低于FSTL1^FL/FL小鼠。此外，FSTL1^M-KO小鼠中血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平較低(圖2B)。此外，FSTL^{M- KO}小鼠肝臟組織中TGF-β、TIMP- 1和I型膠原蛋白的表達(dá)明顯低于同窩小鼠(圖2C)。WB分析進(jìn)一步表明，FSTL1缺失降低了纖維化肝組織中I型膠原、α-SMA和TIMP- 1的表達(dá)(圖2 D)。我們的結(jié)果表明，髓系FSTL1缺乏可減輕小鼠的肝纖維化。

3）髓系FSTL1缺乏可減輕纖維化肝中的炎癥和巨噬細(xì)胞/中性粒細(xì)胞招募

我們研究了FSTL1⁺巨噬細(xì)胞對(duì)纖維化肝組織局部炎癥的影響。圖3A顯示FSTL1^M-KO小鼠的纖維化肝臟中TNF-α和IL-1β的表達(dá)低于對(duì)照組，IL-10的表達(dá)高于對(duì)照組。一致的是，FSTL1^M-KO小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平較低，而IL-10高于同窩小鼠(圖3B)。此外，我們通過F4/80和CD11b(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)和Ly6G(中性粒細(xì)胞標(biāo)記物)染色評(píng)估纖維化肝組織中肝臟炎癥細(xì)胞的積累。與FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系特異性FSTL1缺乏顯著降低纖維化肝組織中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3C-E)。

4）髓系FSTL1缺乏可抑制纖維化肝臟中M1極化和NF-κB通路激活

如上所述，髓系特異性FSTL1缺失可減輕肝臟炎癥，提示FSTL1可能促進(jìn)M1極化。首先，我們分析了肝臟切片中M1巨噬細(xì)胞的定量，結(jié)果顯示FSTL1^{M- KO}小鼠中觀察到的iNOS+CD68+巨噬細(xì)胞比FSTL1^FL/FL小鼠中要少(圖4A)。此外，在FSTL1^M-KO小鼠中，iNOS mRNA表達(dá)下調(diào)，而Arg1在纖維化肝臟中表達(dá)上調(diào)(圖4B)。WB分析顯示，與對(duì)照組相比，髓系FSTL1缺陷小鼠纖維化肝臟中iNOS和p-STAT1的表達(dá)減少，p-STAT6的表達(dá)增加(圖4C)。TLR-4/ NF-κB通路在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的急性/慢性肝臟炎癥中是一個(gè)特性良好的調(diào)控通路。在此，纖維化肝臟的免疫染色和WB分析也顯示FSTL1^{M- KO}小鼠表現(xiàn)出TLR- 4/NF-κB通路激活的抑制(圖4D,E)。

5）FSTL1直接與PKM2結(jié)合，增強(qiáng)PKM2在巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞FSTL1在肝纖維化過程中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，我們采用免疫沉淀(IP)法和LC- MS/MS篩選法探索FSTL1與巨噬細(xì)胞中潛在蛋白的結(jié)合。我們特別感興趣的是確定PKM2是否與巨噬細(xì)胞中的FSTL1直接相互作用(圖5A,B)。結(jié)果顯示FSTL1在巨噬細(xì)胞中與PKM2結(jié)合(圖5C)。此外，共聚焦免疫熒光分析顯示，FSTL1與PKM2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中共定位(圖5D)。接下來，我們分析了FSTL1- PKM2相互作用的關(guān)鍵域。根據(jù)之前報(bào)道的FSTL1和PKM2的結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了編碼4個(gè)帶有HA標(biāo)記的FSTL1截短片段和3個(gè)帶有FLAG標(biāo)記的PKM2截短片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞(圖5E)。我們的數(shù)據(jù)顯示FSTL1的FK結(jié)構(gòu)域?qū)?/span>PKM2的N-端或C-端相互作用至關(guān)重要(圖5F)。環(huán)己酰亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在FSTL1下調(diào)的細(xì)胞中，PKM2的半衰期較短，而在FSTL1過表達(dá)的細(xì)胞中，PKM2的半衰期比對(duì)照細(xì)胞長(zhǎng)得多(圖5G)。這些結(jié)果表明，FSTL1可能通過抑制蛋白酶體降解來調(diào)控PKM2的穩(wěn)定性。值得注意的是，我們觀察到在FSTL1^M-KO和FSTL1^o/e骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)培養(yǎng)物中加入MG-132后，PKM2蛋白水平降低并伴有FSTL1下調(diào)的情況得到了恢復(fù)(圖5H)。然后，利用體外泛素化實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)FSTL1是否參與泛素介導(dǎo)的PKM2降解。下調(diào)FSTL1可增加FSTL1^M-KO BMDMs中PKM2蛋白的泛素化水平。泛素介導(dǎo)的PKM2降解作用在FSTL1過表達(dá)的BMDMs中明顯消失(圖5I)。

6）FSTL1促進(jìn)纖維化肝組織巨噬細(xì)胞中的PKM2磷酸化和核易位

為了探索PKM2在FSTL1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎表型轉(zhuǎn)換中的作用，我們首先檢測(cè)了肝纖維化巨噬細(xì)胞中PKM2的表達(dá)是否發(fā)生改變。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，纖維化肝臟中有更多的FSTL1+巨噬細(xì)胞和PKM2+巨噬細(xì)胞(圖6A)。然后，我們分析了PKM2和FSTL1在人肝臟標(biāo)本細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白表達(dá)，顯示PKM2和FSTL1在纖維化肝組織胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)均顯著增加(圖6B)，免疫熒光染色也顯示患者肝臟巨噬細(xì)胞中PKM2和FSTL1的核易位顯著增加(圖6A)。人類纖維化肝臟的結(jié)果與小鼠纖維化肝臟的結(jié)果相似。相反，與FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系FSTL1的破壞明顯減少了PKM2+巨噬細(xì)胞，并阻礙了PKM2在肝巨噬細(xì)胞中的核導(dǎo)入(圖6C)。圖6D顯示，與FSTL1^FL/FL對(duì)照相比，FSTL1缺失降低了細(xì)胞質(zhì)中總PKM2和p-PKM2的表達(dá)，進(jìn)而降低了細(xì)胞核中總PKM2的表達(dá)。總之，這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞FSTL1促進(jìn)PKM2的核易位。

7）FSTL1缺失可減輕巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、M1極化和糖酵解

我們進(jìn)一步分析FSTL1在體外對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。FSTL1^M-KO巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β表達(dá)降低，IL-10表達(dá)增加(圖7A,B)。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，LPS處理后，FSTL1缺失減弱了M1極化，并降低了BMDMs中TLR-4/NF-κB通路的激活(圖7C-G)。接下來，我們探討了FSTL1缺乏是否能減少體外PKM2的表達(dá)和核易位。在FSTL1^M-KO BMDMs中，PKM2的表達(dá)及其核易位減弱(圖7C,D)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與FSTL1^FL/FL BMDMs相比，LPS刺激后FSTL1^{M- KO} BMDMs中的ECAR和乳酸顯著降低(圖7H,I)。我們使用糖酵解抑制劑 2-DG阻斷葡萄糖供應(yīng)，發(fā)現(xiàn)FSTL1^M-KO BMDMs中IL-1β和iNOS表達(dá)的下降受到抑制(圖7J)。

8）PKM2激活物抑制FSTL1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化和糖酵解

為了進(jìn)一步確定PKM2對(duì)FSTL1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化和糖酵解的影響，用小分子PKM2激活劑DASA-58處理過表達(dá)FSTL1 (FSTL1^o/e)的BMDMs。DASA-58減輕FSTL1^o/e誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β，同時(shí)增加IL-10水平(圖8A,B)。PKM2、iNOS和p65的免疫熒光染色顯示，PKM2核易位抑制逆轉(zhuǎn)了FSTL1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化和NF-κB活化(圖8C,D)。WB分析證實(shí)了BMDMs中PKM2、p- PKM2、iNOS、p-STAT1、p-STAT6、TLR-4、p-Ikk和p-p65的表達(dá)(圖8E-G)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PKM2在FSTL1介導(dǎo)的糖酵解中的作用，我們檢測(cè)了ECAR和相對(duì)乳酸釋放水平。FSTL1^o/e BMDMs中的ECAR和乳酸顯著高于FSTL1^n/e BMDMs，而DASA-58有效地逆轉(zhuǎn)了FSTL1^o/e誘導(dǎo)的糖酵解增加(圖8H,I)。此外，FSTL1^o/e相關(guān)的促炎介質(zhì)(IL- 1β和iNOS)被2-DG中和(圖8J)。

結(jié)論：FSTL1通過與PKM2結(jié)合，促進(jìn)PKM2磷酸化，抑制PKM2泛素化，從而促進(jìn)M1極化、糖酵解和炎癥反應(yīng)。我們的發(fā)現(xiàn)為改善巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化的新治療方法提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：
Rao J, Wang H, Ni M, Wang Z, Wang Z, Wei S, Liu M, Wang P, Qiu J, Zhang L, Wu C, Shen H, Wang X, Cheng F, Lu L. FSTL1 promotes liver fibrosis by reprogramming macrophage function through modulating the intracellular function of PKM2. Gut. 2022 Feb 9:gutjnl-2021-325150. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325150.