CDK16通過磷酸化PRC1促進(jìn)三陰性乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

   細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶16 (CDK16)是一種非典型的PCTAIRE激酶，其活性依賴于細(xì)胞周期蛋白Y (CCNY)家族。CCNYs已被報道調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞的活性和乳腺的發(fā)育，是多種癌癥中的一種癌蛋白。然而，目前尚不清楚CDK16是否在乳腺癌中發(fā)揮作用，以及是否可以作為乳腺癌的治療靶點(diǎn)。鑒于此，有相關(guān)研究提出CDK16在三陰性乳腺癌（TNBC）中起著關(guān)鍵作用，是一種新的TNBC治療靶點(diǎn)，該研究在2022年4月發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CDK16在TNBC中高表達(dá)，且與不良臨床結(jié)果相關(guān)

作者分析了CCNY依賴性非典型CDKs的表達(dá)和臨床相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CDK16在所有乳腺癌亞型中均有表達(dá)，在基底樣乳腺癌樣本中表達(dá)最高(圖1A)。此外，CDK16高表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖1B-D)。與TCGA數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致，乳腺癌聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(圖1E)和GSE76250數(shù)據(jù)集(圖1G)也發(fā)現(xiàn)TNBC中CDK16表達(dá)水平高于正常乳腺組織，且CDK16高表達(dá)與不良臨床結(jié)果呈正相關(guān)(圖1F)。此外，CPTAC數(shù)據(jù)庫分析顯示，乳腺腫瘤組織中CDK16蛋白表達(dá)較正常乳腺組織顯著升高(圖1H)。在所有乳腺癌亞型中，CDK16僅在TNBC中升高(圖1I)。使用組織芯片（T=50, P=4）進(jìn)行免疫組化(IHC)分析，免疫組化分析顯示，TNBC腫瘤中CDK16蛋白的表達(dá)明顯高于鄰近的非癌組織，并主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖1J)。臨床樣本（N=6, T=6）檢測進(jìn)一步證實(shí)了TNBC中CDK16蛋白表達(dá)的增加（圖1K）。這些數(shù)據(jù)表明高表達(dá)的CDK16可能在TNBC的進(jìn)展中發(fā)揮作用。

圖1 CDK16在TNBC中高表達(dá)，與不良臨床結(jié)果相關(guān)

2. 抑制CDK16在體內(nèi)外均可抑制TNBC的腫瘤生長

集落形成分析顯示，CDK16敲低顯著降低了TNBC細(xì)胞的增殖和克隆能力(圖2A, B)。為了確定CDK16的功能是否取決于其酶活性，通過靶向CDK16 3’-UTR的shRNA耗盡內(nèi)源性CDK16，然后恢復(fù)shRNA耐藥的野生型CDK16 (CDK16)或激酶不活化的CDK16D304A突變體(D304A)。盡管過表達(dá)效率相當(dāng)(圖2C)，野生型CDK16而非CDK16D304A突變體可以挽救2D-colony形成分析顯示的細(xì)胞增殖缺陷(圖2D, E)，這表明CDK16在TNBC中的功能需要激酶活性。

進(jìn)一步使用兩個細(xì)胞系來源的異種移植(CDX)模型來研究CDK16在TNBC進(jìn)展中的作用。CDK16基因敲除（CDK16-KD）顯著延遲了異種移植瘤模型的腫瘤形成(圖2F)，抑制了腫瘤生長，與對照組相比，CDK16-KD組的腫瘤體積、質(zhì)量和大小都有所減少(圖2G-I)。另一種異種移植模型得到了一致的結(jié)果(圖2J-M)?？傊?，這些結(jié)果表明CDK16對TNBC進(jìn)展至關(guān)重要。

圖2 CDK16敲低可抑制TNBC的體內(nèi)外腫瘤生長

3. 在患者來源的類器官和異種移植模型中，CDK16的下調(diào)抑制TNBC的腫瘤進(jìn)展

考慮到臨床意義，建立了PDO和PDX模型(圖3A)，以進(jìn)一步評估靶向CDK16在TNBC中的治療效果。與CDX模型的觀察結(jié)果一致，在所有三個PDO模型中，與對照組相比，CDK16-KD組的類器官形成效率和類器官生長顯著降低 (圖3B-D)，表明CDK16敲低抑制了TNBC的進(jìn)展。類器官Ki67染色分析顯示，CDK16-KD組各類器官中Ki67+細(xì)胞的比例明顯低于對照組，對應(yīng)于CDK16-KD類器官的增殖抑制表型(圖3E)。PDX模型的結(jié)果進(jìn)一步驗證了靶向CDK16在TNBC中的抗腫瘤作用：減緩腫瘤發(fā)生(圖3F)，抑制腫瘤生長(圖3G)，最終抑制腫瘤進(jìn)展(圖3H, I)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明靶向CDK16在TNBC的臨床治療中具有巨大的潛力。

圖3在患者來源的類器官和異種移植模型中，CDK16的下調(diào)抑制TNBC的腫瘤進(jìn)展

4. CDK16促進(jìn)TNBC細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移

乳腺癌患者CDK16表達(dá)與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險呈正相關(guān)，提示CDK16可能參與TNBC轉(zhuǎn)移。為了驗證這一可能性，通過生物發(fā)光成像(BLI)定量監(jiān)測體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。western blot分析證實(shí)CDK16過表達(dá)(CDK16-OE) (圖4A)。Transwell和愈合化驗顯示，CDK16-OE顯著提升細(xì)胞入侵和遷移(圖4 B, C)。體內(nèi),老鼠的metastasis-free生存時間軸承CDK16-OE細(xì)胞相比明顯縮短小鼠的軸承控制細(xì)胞(圖4 d, E)，而CDK16-OE嚴(yán)重加重肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān) (圖4D, F)和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖4G, H)。H&E分析顯示，CDK16-OE導(dǎo)致肺組織嚴(yán)重結(jié)構(gòu)損傷(圖4G)。而CDK16-KD顯著降低了4T1細(xì)胞的遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移(圖4I)，而CDK16-OE過表達(dá)顯著促進(jìn)了EMT6細(xì)胞向多個器官的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，這在體內(nèi)和體外BLI數(shù)據(jù)中得到了證實(shí)(圖4J)?？傊@些結(jié)果表明CDK16對TNBC轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。

圖4 CDK16促進(jìn)TNBC細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移

5. CDK16通過磷酸化PRC1和調(diào)節(jié)紡錘體形成來調(diào)控細(xì)胞增殖

為了研究CDK16參與TNBC進(jìn)展的分子機(jī)制，通過RNA測序分析了CDK16-KD MDA-MB-231細(xì)胞和對照細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。先前文獻(xiàn)報道CDK16與紡錘體有關(guān)，同GO分析一樣。因此檢測有絲分裂過程中的紡錘體形成，觀察到CDK16-KD MDA-MB-231細(xì)胞中有明顯的紡錘體形成缺陷(圖5A)。免疫印跡分析顯示，T481位點(diǎn)（CDK依賴的主要磷酸化位點(diǎn)）的PRC1磷酸化隨著細(xì)胞周期過程中CDK16蛋白的豐度而波動（圖5B），并且在MDA-MB-231細(xì)胞中，CDK16敲除后PRC1的磷酸化水平明顯降低（圖5C）。此外，在CDK16敲除后，PRC1靶向基因的表達(dá)顯著改變：細(xì)胞周期相關(guān)基因下調(diào)，凋亡相關(guān)基因上調(diào)(圖5D)。PRC1的亞細(xì)胞定位決定了其在細(xì)胞增殖中的作用，通過免疫染色(圖5E)和免疫印跡分析(圖5F)，進(jìn)一步觀察到PRC1在CDK16-KD細(xì)胞中明顯的核滯留。

MDA-MB-231細(xì)胞的2D增殖分析顯示，磷酸化模擬的PRC1^T481D突變體顯著拯救了受抑制的細(xì)胞增殖，而磷酸化缺失的PRC1^T481A突變體則沒有這種拯救作用(圖5G, H)。提示CDK16對TNBC細(xì)胞增殖的調(diào)控作用是通過磷酸化PRC1實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，這些結(jié)果表明CDK16通過磷酸化PRC1來發(fā)揮其在TNBC中的功能。

圖5 CDK16通過磷酸化PRC1和調(diào)節(jié)紡錘體形成來調(diào)控細(xì)胞增殖

6. CDK16藥理抑制可抑制TNBC的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

與TNBC細(xì)胞系相比，細(xì)胞系MCF-7和T47D對Reb（CDK16抑制劑）敏感性較低(圖6A)。免疫印跡分析顯示，Reb處理降低了T481位點(diǎn)的PRC1磷酸化，并導(dǎo)致PRC1的核保留(圖6B, C)。Reb治療顯著抑制腫瘤生長，從單個腫瘤體積、平均腫瘤體積、腫瘤重量和腫瘤大小可以看出(圖6D-G)。在PDO模型中，Reb存在時腫瘤類器官的大小和數(shù)量均顯著減少，但Abe (CDK4/6抑制劑，作為對照)不存在(圖6H, I)。Ki67和cleaved caspase-3的免疫染色評估顯示只有Reb誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖(圖6J)。在PDX模型中，也觀察到Reb具有顯著的抗腫瘤效率 (圖6K-N)。Reb能有效抑制MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移（圖6O,6P）。綜上所述，藥理抑制CDK16可有效抑制TNBC的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，CDK16可作為治療TNBC的一個有希望的靶點(diǎn)。

圖6 CDK16藥理抑制作用對TNBC腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用

7. CDK16抑制參與多種癌癥相關(guān)信號通路

Reb治療后的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。GSEA分析顯示，在Reb處理的細(xì)胞中，有絲分裂紡錘體組織的基因標(biāo)記(圖7A)和G2/M檢查點(diǎn)(圖7B)下調(diào)。Rb-E2F基因標(biāo)記也受到了Reb治療(圖7C)或CDK16敲除(圖7D)的影響。熱圖顯示，Rb-E2F途徑的靶基因在Reb處理（圖7E）或CDK16敲除（圖7F）后下調(diào)。免疫印跡分析證實(shí)，在Reb治療（圖7G）或CDK16敲除（圖7H）后，Rb磷酸化顯著降低。此外，通過qPCR分析，Reb治療（圖7I）或CDK16敲除（圖7J）后，受Rb-E2F信號直接調(diào)節(jié)的基因表達(dá)顯著下調(diào)?？傊@些結(jié)果表明CDK16通過磷酸化Rb來調(diào)節(jié)Rb-E2F信號。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持CDK16抑制參與多種癌癥相關(guān)信號通路，這可能有助于CDK16與PRC1共同調(diào)控TNBC進(jìn)展。

圖7 CDK16抑制參與多種癌癥相關(guān)信號通路

結(jié)論

CDK16在乳腺癌，尤其是TNBC中高表達(dá)，其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，促進(jìn)TNBC的惡性活動。機(jī)制上，CDK16通過磷酸化PRC1和調(diào)節(jié)有絲分裂期間紡錘體的形成發(fā)揮致癌作用。有趣的是，CDK16抑制也抑制Rb磷酸化和Rb-E2F信號?？傊?，該研究為非典型CDK在癌癥中的作用提供了新的見解，并強(qiáng)調(diào)CDK16是TNBC一個有希望的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Li X, Li J, Xu L, Wei W, Cheng A, Zhang L, Zhang M, Wu G, Cai C. CDK16 promotes the progression and metastasis of triple-negative breast cancer by phosphorylating PRC1. J Exp Clin Cancer Res. 2022;41(1):149. doi: 10.1186/s13046-022-02362-w.