lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-362-3p/MIOX軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌鐵死亡

lncRNA NEAT1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡和腫瘤細(xì)胞的遷移。然而，NEAT1在調(diào)節(jié)腫瘤中鐵死亡中的功能和分子機(jī)制尚不清楚。在這里，我們發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和RSL3通過促進(jìn)p53與NEAT1啟動(dòng)子的結(jié)合來增加NEAT1的表達(dá)。誘導(dǎo)NEAT1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-362-3p促進(jìn)MIOX的表達(dá)。MIOX增加了ROS的產(chǎn)生，降低了細(xì)胞內(nèi)NADPH和GSH的水平，導(dǎo)致erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡增強(qiáng)。重要的是，NEAT1的過表達(dá)通過增強(qiáng)體外和體內(nèi)的鐵死亡，提高了erastin和RSL3的抗腫瘤活性。總的來說，NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-362-3p和MIOX在鐵死亡中發(fā)揮了新的、不可或缺的作用?？紤]到HCC患者對(duì)化療和免疫治療不敏感的臨床發(fā)現(xiàn)，對(duì)于NEAT1高表達(dá)的HCC患者，誘導(dǎo)鐵死亡可能是一種有希望的治療策略。本文于2022年3月發(fā)表于Cell Death and Differentiation（IF=15.828）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）鐵死亡誘導(dǎo)NEAT1表達(dá)依賴于p53

為了鑒定與鐵死亡有關(guān)的lncRNAs，用鐵死亡誘導(dǎo)劑處理肝癌細(xì)胞系HepG2，用RNA-Seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。如圖所示，在erastin和RSL3處理后，40個(gè)lncRNAs導(dǎo)致兩種處理的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，以及分別受erastin或RSL3影響的125或123個(gè)lncRNAs（圖1a、b）。我們根據(jù)差異表達(dá)基因列表挖掘了UALCAN數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了五種有趣的lncRNAs（NEAT1、C11orf95、DIO3OS、HCG18、SNHG12），它們?cè)贖CC中的表達(dá)與正常組織相比顯著（圖1c）。其中，NEAT1的表達(dá)顯著高于其他lncRNAs（圖1d）。因此，我們進(jìn)一步研究NEAT1在鐵死亡中的作用和機(jī)制。

NEAT1有兩種亞型，NEAT1_1在大多數(shù)人體組織中組成性表達(dá)，而NEAT1_2的表達(dá)是組織特異性的。然而，NEAT1的生物學(xué)功能主要來源于NEAT1_2亞型。為了檢測(cè)兩種亞型的表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物來產(chǎn)生兩個(gè)擴(kuò)增子，引物1檢測(cè)到NEAT1_1和NEAT1_2的表達(dá)，引物2僅檢測(cè)到NEAT1_2（圖1e）。如圖1f所示，在erastin和RSL3處理的HCC細(xì)胞中，這兩種轉(zhuǎn)錄物均上調(diào)，表明NEAT1_1和NEAT1_2的表達(dá)在鐵死亡中被誘導(dǎo)。另外，我們發(fā)現(xiàn)，p53的缺失消除了HepG2和HuH-7細(xì)胞中NEAT1的上調(diào)（圖1g，h），表明erastin和RSL3誘導(dǎo)的NEAT1表達(dá)是由p53介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步測(cè)試p53是否直接調(diào)節(jié)NEAT1的轉(zhuǎn)錄，我們使用JASPAR程序分析了NEAT1的啟動(dòng)子區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)p53的結(jié)合序列。然后，我們進(jìn)行ChIP分析，發(fā)現(xiàn)erastin和RSL3處理促進(jìn)了p53與NEAT1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合（圖1i）。此外，我們觀察到在erastin或RSL3處理NEAT1-WT啟動(dòng)子后，啟動(dòng)子活性增加（圖1j）。綜上所述，在鐵死亡誘導(dǎo)條件下，p53直接結(jié)合NEAT1的啟動(dòng)子并促進(jìn)NEAT1的表達(dá)。

2）NEAT1促進(jìn)erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡

為了研究NEAT1是否調(diào)節(jié)鐵死亡，我們構(gòu)建了兩個(gè)NEAT1特異性shRNA。NEAT1 shRNA 1同時(shí)敲除NEAT1_1和NEAT1_2，而NEAT1 shRNA 2僅敲除NEAT1_2，而不影響NEAT1_1的表達(dá)（圖2a、b）。接下來，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)兩種不同NEAT1特異性shRNA的HepG2和HuH-7細(xì)胞系，并用erastin或RSL3處理它們。如圖2c所示，在HepG2或HuH-7細(xì)胞中敲除NEAT1亞型或單獨(dú)敲除NEAT1_2可顯著抑制erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。NEAT1敲除顯著抑制MDA、脂質(zhì)ROS和Fe2+的積累（圖2d、e、f）?？偟膩碚f，NEAT1促進(jìn)erastin和RSL3誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡。

3）NEAT1通過調(diào)節(jié)MIOX的表達(dá)來調(diào)節(jié)鐵死亡

為了進(jìn)一步闡明NEAT1在鐵死亡中的作用機(jī)制，我們通過比較敲除NEAT1導(dǎo)致的基因表達(dá)差異來尋找NEAT1靶基因。如圖3a和b所示，在轉(zhuǎn)染shRNA對(duì)照的HepG2細(xì)胞中，經(jīng)erastin處理后，有1953個(gè)上調(diào)基因和2098個(gè)下調(diào)基因。然而，在轉(zhuǎn)染NEAT1 shRNA的HepG2細(xì)胞中，599個(gè)上調(diào)基因和711個(gè)下調(diào)基因?qū)rastin無反應(yīng)，表明這些基因在鐵死亡中的修飾表達(dá)依賴于NEAT1（圖3a，b）。此外，我們鑒定了6個(gè)上調(diào)基因和15個(gè)下調(diào)基因，它們具有更顯著的修飾（圖3c），并發(fā)現(xiàn)在erastin處理后，MIOX是上調(diào)最高的基因。同時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)表明，erastin和RSL3均不能誘導(dǎo)NEAT1敲除細(xì)胞中MIOX的上調(diào)，這進(jìn)一步證實(shí)了鐵死亡中MIOX表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于NEAT1（圖3d）。MIOX過表達(dá)拯救了由NEAT1缺乏抑制的erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡（圖3e）。MIOX過表達(dá)增加NEAT1敲除細(xì)胞內(nèi)MDA、脂質(zhì)ROS和Fe2+水平（圖3f-h）?？傊?，這些結(jié)果表明NEAT1通過調(diào)節(jié)MIOX的表達(dá)促進(jìn)erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。

4）MIOX通過調(diào)節(jié)Fe2+、GSH和NADPH促進(jìn)鐵死亡

先前的一項(xiàng)研究表明，MIOX過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)鐵積累、GSH活性和NADPH水平，加重順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。為了測(cè)試這種機(jī)制在erastin和RSL3誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞鐵死亡中是否保守，我們?cè)贖CC細(xì)胞中過表達(dá)MIOX，并發(fā)現(xiàn)MIOX促進(jìn)erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖4a）。相反，敲低MIOX可抑制erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖4e）。我們進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的Fe2+水平。如圖4b所示，經(jīng)過erastin和RSL3處理后，MIOX過表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)鐵濃度顯著升高。在用erastin治療后，MIOX的過表達(dá)進(jìn)一步降低了HepG2和HuH-7細(xì)胞中的GSH水平（圖4c）。同樣，NADPH有助于消除脂質(zhì)ROS，并調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，在MIOX過表達(dá)的細(xì)胞中，NADPH也會(huì)降低（圖4d）。相反，在HepG2和HuH-7細(xì)胞中，耗盡MIOX抑制了erastin誘導(dǎo)的HepG2和HuH-7細(xì)胞中Fe2+的積累、NADPH的降低和GSH的降低（圖4f-h）?？傊?，MIOX通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Fe2+、GSH和NADPH水平促進(jìn)鐵死亡（圖4i）。

5）MiR-362-3p參與NEAT1對(duì)MIOX的調(diào)節(jié)

越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs通過與miRNAs（如ceRNA）結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因。為了確定NEAT1在鐵死亡期間是否作為ceRNA發(fā)揮作用，我們使用預(yù)測(cè)工具，使用starbase v2.0和DIANA-LncBase V2，在NEAT1中找到58個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)（圖5a）。由于MIOX被證明是鐵死亡中NEAT1的靶點(diǎn)，我們隨后使用miRTarBase和targetscan在MIOX中尋找潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中都存在43個(gè)潛在的MIOX結(jié)合miRNA（圖5b）。通過比較兩種方法預(yù)測(cè)的miRNA，我們發(fā)現(xiàn)miR-362-3p是唯一重疊的miRNA（圖5c），它可能通過NEAT1介導(dǎo)MIOX和鐵死亡的調(diào)節(jié)。使用兩種公開的生物信息學(xué)工具targetscan和starbase，我們發(fā)現(xiàn)NEAT1和MIOX的3′UTR包含假定的miR-362-3p結(jié)合位點(diǎn)（圖5d）。接下來，我們進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定（圖5e）。如圖5f 所示，在erastin或RSL3處理后，NEAT1的敲除增加了HepG2和HuH-7細(xì)胞中miR-362-3p的表達(dá)水平。相反，NEAT1的過表達(dá)降低了miR362-3p的表達(dá)水平（圖5g）。miR-362-3p的過表達(dá)顯著抑制野生型NEAT1的轉(zhuǎn)錄活性（圖5h）?？傊@些結(jié)果表明NEAT1調(diào)節(jié)miR-362-3p。

為了確定MIOX是否是miR-362-3p的直接靶點(diǎn)，我們將miR-362-3p過表達(dá)載體與包含MIOX的3′UTR的報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)染。如圖5i所示，miR-362-3p的過表達(dá)顯著減弱了含有MIOX野生型3′UTR的報(bào)告載體的熒光素酶活性。相反，序列的突變阻斷了miR-362-3p的抑制作用（圖5i）。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-362-3p對(duì)MIOX 3’UTR活性的影響可以通過過表達(dá)的NEAT1部分恢復(fù)（圖5i）。為了進(jìn)一步證明miR-362-3p參與MIOX和NEAT1之間的交叉調(diào)節(jié)，我們?cè)u(píng)估了MIOX的表達(dá)。在erastin或RSL3處理的HepG2細(xì)胞中，NEAT1敲除抑制了MIOX的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。相反，miR-362-3p的敲除顯著增加了被NEAT1 shRNA抑制的MIOX的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖5j）。此外，野生型NEAT1的過表達(dá)增加了MIOX的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。miR-362-3p的過表達(dá)顯著抑制NEAT1誘導(dǎo)的MIOX的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖5k）。miRNA以Ago2依賴的方式抑制mRNA的翻譯和降解。為了測(cè)試MIOX和miR-362-3p之間的相互作用是否受到NEAT1的影響，對(duì)NEAT1過表達(dá)或敲除的HepG2細(xì)胞進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。如圖5l所示，被Ago2-miR-362-3p復(fù)合物拉下的MIOX mRNA水平在NEAT1缺失的HepG2細(xì)胞中顯著富集，而過表達(dá)NEAT1則顯著降低MIOX mRNA水平（圖5m）?？傊?，這些結(jié)果表明NEAT1通過miR-362-3p積極調(diào)節(jié)MIOX表達(dá)。

6）MiR-362-3p通過調(diào)節(jié)MIOX抑制鐵死亡

為了分析miR-362-3p是否通過對(duì)MIOX的影響來調(diào)節(jié)鐵死亡，我們通過過表達(dá)MIOX進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染miR-362-3p的HepG2細(xì)胞顯著抑制erastin和RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并降低MIOX的促進(jìn)作用（圖6a）。同時(shí)，過表達(dá)MIOX后，MDA、脂質(zhì)ROS和Fe2+的積累也部分恢復(fù)（圖6b-d）。此外，MIOX的過表達(dá)抑制了由miR-362-3p誘導(dǎo)的GSH和NADPH的細(xì)胞內(nèi)水平（圖6e，f）。轉(zhuǎn)染miR-362-3p海綿的HepG2細(xì)胞顯著促進(jìn)了erastin-和RSL3-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和相關(guān)的鐵死亡，包括脂質(zhì)ROS產(chǎn)生、鐵積累、NADPH抑制和erastin誘導(dǎo)的GSH缺失(圖6g-l)。MIOX的下調(diào)抑制了由miR-362-3p海綿促進(jìn)的erastin-和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡(圖6g-l)。這些結(jié)果表明miR-362-3p通過調(diào)節(jié)MIOX的表達(dá)來調(diào)節(jié)鐵死亡。

7）NEAT1過表達(dá)促進(jìn)erastin或RSL3在體內(nèi)外誘導(dǎo)的鐵死亡

我們通過慢病毒載體在HepG2和HuH-7細(xì)胞中穩(wěn)定地過表達(dá)NEAT1，用erastin或RSL3處理細(xì)胞，然后通過集落形成測(cè)定其對(duì)細(xì)胞活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)NEAT1高表達(dá)水平的細(xì)胞對(duì)erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡細(xì)胞死亡更敏感（圖7a ）。進(jìn)一步探討NEAT1表達(dá)水平對(duì)erastin或RSL3體內(nèi)抗癌活性的影響。將NEAT1穩(wěn)定過表達(dá)的HepG2和HuH-7細(xì)胞皮下注射到NU/NU裸鼠體內(nèi)。NEAT1表達(dá)增加的腫瘤的大小明顯小于使用相同藥物治療的對(duì)照組（圖7b、c），并且表現(xiàn)出MDA水平升高和erastin誘導(dǎo)的GSH水平降低（圖7d、e）。此外，在NEAT1過表達(dá)細(xì)胞中用erastin或RSL3處理后，4-HNE的染色顯著增加（圖7f）。同樣地，在NEAT1過表達(dá)細(xì)胞中，MIOX表達(dá)顯著升高。ISH染色證實(shí)，erastin或RSL3處理后，NEAT1過表達(dá)細(xì)胞中miR-362-3p的表達(dá)降低（圖7f）?？傊?， NEAT1調(diào)節(jié)了erastin和RSL3在HCC細(xì)胞中的抗腫瘤活性。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果概述了NEAT1在鐵死亡中的關(guān)鍵作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，表明對(duì)于高表達(dá)NEAT1的腫瘤患者，誘導(dǎo)鐵死亡可能是一種有前途的治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Zhang Y, Luo M, Cui X, O'Connell D, Yang Y. Long noncoding RNA NEAT1 promotes ferroptosis by modulating the miR-362-3p/MIOX axis as a ceRNA. Cell Death Differ. 2022 Mar 25. doi: 10.1038/s41418-022-00970-9. Epub ahead of print. PMID: 35338333.