心臟成纖維細(xì)胞通過Htra3-TGF-β-IGFBP7軸調(diào)控心力衰竭的發(fā)生發(fā)展

組織纖維化和器官功能障礙是包括心力衰竭在內(nèi)的與年齡相關(guān)的疾病的特征，但是否有一個(gè)共同的途徑來誘發(fā)這兩種事件仍不清楚。假設(shè)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間可能存在通信，作者利用單細(xì)胞RNA-seq繪制的心臟細(xì)胞-細(xì)胞通訊圖。本文于2022年3月發(fā)表于《Nature communications》，IF= 12.121。

本文技術(shù)路線：

本文主要內(nèi)容：

1、 單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析確定Htra3是心臟成纖維細(xì)胞的中心分子

為了研究導(dǎo)致衰竭心肌細(xì)胞誘導(dǎo)的分子相互作用，在進(jìn)行主動脈橫向收縮術(shù)(TAC)或假手術(shù)的小鼠中，于2周后分離了心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞(Fig. 1A)。利用所有數(shù)據(jù)集中的1019個(gè)配體和受體(LR)表達(dá)譜，作者生成了一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，并揭示了心臟中LR的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄特性 (Fig. 1B)。接下來，使用LR相互作用數(shù)據(jù)庫重新構(gòu)建心臟LR相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并顯示相同或不同細(xì)胞類型之間潛在的綜合相互作用(Fig.1C)。通路分析顯示，PI3K-Akt、Rap1和TGF-β信號通路等特異性信號通路在心臟中被強(qiáng)烈激活(Fig.1d)。在各種細(xì)胞類型中，在包括心臟成纖維細(xì)胞與包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型的相互作用最強(qiáng)(Fig.1e)。TAC引起的超負(fù)荷的壓力增加心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量，其中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因如Ctgf、Tgfb1和Fbn1被激活(Fig.1f)。

通過生成心臟成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，作者確定Htra3是位于網(wǎng)絡(luò)中心的分子(Fig.1g)。Htra3的表達(dá)與心臟成纖維細(xì)胞模塊的表達(dá)有很強(qiáng)的相關(guān)性(Fig.1h)，提示Htra3心臟成纖維細(xì)胞的身份。但其在心臟中的作用尚不清楚。心臟成纖維細(xì)胞特異性Htra3表達(dá)經(jīng)scRNA-seq證實(shí)(Fig. 1j)。另外，作者也確認(rèn)了HTRA3在人心臟間質(zhì)中的表達(dá)(Fig. 1k)。

Fig1  單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)分析鑒定心臟成纖維細(xì)胞Htra3

2、心臟成纖維細(xì)胞Htra3支配心臟穩(wěn)態(tài)，并因壓力過載而下調(diào)

與野生型相比,對照組小鼠，Htra3 KO小鼠即使在沒有壓力過載的情況下也表現(xiàn)出心肌肥厚，心肌細(xì)胞體積增大，而血壓沒有變化(Fig 2a-c)。TAC引起的輕微壓力過載可迅速誘導(dǎo)Htra3 KO小鼠嚴(yán)重心力衰竭，但在WT小鼠中不明顯(Fig 2b)。TAC對Htra3 KO小鼠的引起的心肌纖維化比WT小鼠嚴(yán)重(Fig 2d)。壓力過載降低了WT小鼠心肌成纖維細(xì)胞中的Htra3(Fig 2e)。人類心臟的scRNA-seq證實(shí)HTRA3在心臟成纖維細(xì)胞中特異表達(dá)，在衰竭心臟中表達(dá)減少(Fig 2f)。機(jī)械拉伸對分離的原代心臟成纖維細(xì)胞中抑制tra3和Tgfb1表達(dá)增加(Fig 2g)。這些結(jié)果表明，Htra3特異表達(dá)于心臟成纖維細(xì)胞，對于維持心臟基本大小和抵抗血流動力學(xué)過載至關(guān)重要，而心臟成纖維細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)激會降低Htra3的表達(dá)。

Fig2 Htra3 KO小鼠心肌及心肌細(xì)胞肥大，易受機(jī)械應(yīng)激影響

3. htra3誘導(dǎo)TGF-β降解對預(yù)防心力衰竭和纖維化至關(guān)重要

在TAC引起的輕微壓力過載小鼠或假手術(shù)的WT和Htra3 KO小鼠中，于2周后對使用Pdgfr-α抗體分離的心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行全長scRNA-seq(Fig 1a)。UMAP繪圖和基于圖形的聚類將心肌成纖維細(xì)胞分成三個(gè)聚類(C1-3)，假時(shí)間分析顯示兩條軌跡(Fig 3a,b)。成纖維細(xì)胞軌跡1(來自C1 - C2)主要是由Htra3缺失引起，而成纖維細(xì)胞軌跡2 (C1 - C3)是由壓力過載引起的，Htra3缺失或不缺失均可 (Fig. 3a-c)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和隨機(jī)分析明確了M1和M17模塊顯著參與細(xì)胞分類(它們的模塊活性相互排斥(Fig. 3d)。M1模塊在心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)，包含先天免疫和toll樣受體信號通路相關(guān)基因（包括Tlr2和Tlr4）(Fig 3e, f)。軌跡1和軌跡2中M1模塊的活性被強(qiáng)烈抑制(Fig 3e-g)。

M17模塊富含參與細(xì)胞外基質(zhì)形成和TGF-β信號通路的基因，它們的活性在兩個(gè)軌跡1和2中都有不同程度的上調(diào) (Fig. 3h-j)。無論是壓力過載，還是Htra3缺失激活M17，它們一起協(xié)同增強(qiáng)其活性(Fig. 3j)。膠原原纖維組織基因Col1a1和Col3a1的表達(dá)在兩種軌跡中都被激活，而TGF-β信號分子的表達(dá)，如Tgfb3和Tgfbr2，以及活化心臟成纖維細(xì)胞6的標(biāo)志物Postn，僅在軌跡2中被激活(Fig. 3i)。這些結(jié)果表明Htra3基本抑制TGF-β信號，壓力過載和Htra3缺失協(xié)同激活TGF-β信號，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞活化。

Fig3心臟成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞rna序列顯示Htra3通過TGF-β抑制維持其靜止?fàn)顟B(tài)

4. Htra3抑制誘導(dǎo)的TGF-β信號激活促進(jìn)衰老衰竭心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)

為了了解TGF-β信號的激活如何影響心肌細(xì)胞并導(dǎo)致心力衰竭，作者在TAC輕微壓力過載小鼠或假手術(shù)小鼠后在2周后對WT和Htra3 KO小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq檢測。UMAP將心肌細(xì)胞劃分為4個(gè)簇，假時(shí)間分析顯示2條軌跡(Fig 4a, b)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和隨機(jī)森林分析識別模塊M1和M2在細(xì)胞分類中起重要作用。Htra3缺失，TAC輕微壓力過載，以及它們的聯(lián)合誘導(dǎo)了C1心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)向C2, C3和C4(Fig. 4b)。富含線粒體氧化磷酸化和DNA修復(fù)相關(guān)基因(如Atm、Parp1/2和Rpa2)的M1模塊在軌跡1和軌跡2中均被顯著抑制(Fig 4d - f)，這表明激活TGF-β信號可以抑制線粒體和DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)(Fig 4d, e)。在Htra3 KO小鼠心肌細(xì)胞中，參與氧化還原過程的基因被下調(diào)，在無壓力過載的情況下，蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào), 可能導(dǎo)致htra3ko小鼠心肌細(xì)胞肥大 (Fig. 2c)。

模塊M2，包含與GTPase小信號(如Rhob和Rac1)、TGF-β受體信號(如Ltbp4和Tgfbr2)和p53信號(如Trp53和Cdkn1a)，在C4中通過軌跡2特異激活 (Fig. 4g–i)。Htra3缺失和壓力過載的聯(lián)合作用顯著促進(jìn)了用抗γH2A抗體染色的衰竭心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)(Fig. 4j)。作者還證實(shí)了TAC手術(shù)后，Htra3 KO小鼠心肌細(xì)胞DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)增加(Fig.4k)。M2還含有多種分泌因子，包括Bmp1、Cxcl12、Igfbp7，提示表達(dá)M2的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出DNA損傷誘導(dǎo)的分泌表型，類似于衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)(Fig 4l)。聚類分析發(fā)現(xiàn)，模塊M9富含編碼膠原纖維組織相關(guān)蛋白的基因(如Col1a1, Col3a1和Fbn1)和TGF-β信號傳導(dǎo)(如Tgfb3, Nox4, 和Postn)，也像M2一樣在C4中被特異性激活 (Fig. 4m-o)。

Fig4 心肌細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq表明，Htra3可以防止心肌細(xì)胞衰老衰竭的誘導(dǎo)

5. TGF-β誘導(dǎo)的Nox4表達(dá)及隨后的p53激活對誘導(dǎo)具有分泌表型的衰竭心肌細(xì)胞至關(guān)重要

作者注射了Nox4- shRNA腺相關(guān)病毒9 (AAV9)載體來抑制Nox4的表達(dá)(Fig 5a)。超聲心動圖顯示，在TAC手術(shù)后htra3ko小鼠中，敲除Nox4可挽救其心功能障礙(Fig 5b)。免疫染色和western blot分析顯示，Nox4抑制可顯著降低DNA損傷(Fig 5c, d)和TGF-β信號蛋白相關(guān)分子的表達(dá)(Fig 5e)。作者在TAC手術(shù)后1周將AAV9-Htra3載體注入WT小鼠體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)心臟Htra3過表達(dá)抑制TGF-β信號傳導(dǎo)，改善心功能障礙和纖維化。

Fig5 TGF-β誘導(dǎo)的Nox4激活可誘導(dǎo)衰老衰竭心肌細(xì)胞和心力衰竭

6、空間轉(zhuǎn)錄組顯示Htra3-TGF-β軸在心肌梗死后心肌纖維化和心肌細(xì)胞分泌表型誘導(dǎo)中起重要作用

為了闡明Htra3如何在空間上調(diào)控心臟重構(gòu)，作者研究了Htra3在心肌梗死(MI)模型中的作用。Visium (10X Genomics)的空間轉(zhuǎn)錄組分析顯示心肌梗死后梗死區(qū)Htra3高表達(dá)，提示心肌重構(gòu)可能存在空間調(diào)控(Fig 6a)。與WT小鼠相比，Htra3 KO小鼠心肌梗死后出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟重構(gòu)(Fig 6b)。超聲心動圖分析顯示Htra3KO小鼠表現(xiàn)出明顯的心臟擴(kuò)張和收縮功能障礙 (Fig 6c)。通過對野生型和Htra3 KO小鼠假手術(shù)或MI手術(shù)后心臟組織的空間轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了具有空間定位特征的特定基因集群(Fig.6d)和特異性表達(dá)譜Htra3(Fig. 6e)。MI誘導(dǎo)了線粒體中簇1基因的表達(dá) (Fig. 6d, e)。Htra3 KO小鼠心肌梗死后，與梗死區(qū)對應(yīng)的簇2區(qū)域擴(kuò)大（Fig. 6d）。利用scRNA-seq圖譜對空間定位點(diǎn)進(jìn)行反螺旋分析，表明成纖維細(xì)胞在聚類2的區(qū)域高度富集(Fig. 6f)。作者還利用scRNA-seq譜對MI后心肌細(xì)胞進(jìn)行了軌跡分析，發(fā)現(xiàn)MI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞以TGF-β信號相關(guān)分子和分泌因子的表達(dá)為特征 (Fig. 6g, h)?？臻g轉(zhuǎn)錄組分析顯示，這些基因與細(xì)胞外基質(zhì)基因在心肌梗死后Htra3 KO小鼠的梗死區(qū)特異激活 (Fig. 6i)。提示Htra3下調(diào)可促進(jìn)心肌纖維化，誘導(dǎo)梗死區(qū)心肌細(xì)胞分泌表型。

 Fig6 空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示Htra3抑制介導(dǎo)的衰老衰竭心肌細(xì)胞空間誘導(dǎo)

7、 沉默外泌體來源的circTRPS1通過GLS1調(diào)控抑制了BCa在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移

UMAP繪圖和基于圖形的聚類將心肌細(xì)胞分為3個(gè)聚類，假時(shí)間分析顯示2條軌跡(Fig 7a, b)。軌跡1和軌跡2分別對應(yīng)C1到C2和C1到C3的過渡(Fig7b)。對照組心肌細(xì)胞主要屬于C1，心衰患者心肌細(xì)胞主要屬于C2或C3(Fig 7c)。M2富含與線粒體電子傳輸和ATP生物合成有關(guān)的基因(Fig 7d)，在兩種軌跡中都受到抑制 (Fig. 7d–f)。DNA損傷反應(yīng)(CDKN1A、MDM4和RBX1)在軌跡中特異激活M2(Fig7g-i)，其中M1和M2在模塊活動中表現(xiàn)出互斥關(guān)系 (Fig. 7j)。M1還含有特異性表達(dá)于小鼠衰老心肌細(xì)胞的分泌因子(Fig.7h)。此外，M44與細(xì)胞外基質(zhì)組織相關(guān)的基因富集，并在軌跡2中特異激活 (Fig. 7k-m)。衰老衰竭心肌細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子TGF-β3、LTBP4和IGFBP7的水平在心力衰竭患者中較高(取決于嚴(yán)重程度)，移植后較低，類似于NT-proBNP（一種成熟的心力衰竭生物標(biāo)志物）(Fig. 7n)。隨機(jī)森林分析表明，IGFBP7蛋白在非晚期心力衰竭和晚期心力衰竭的分類中起著最重要的作用(Fig.7o)。受體工作特征分析顯示NT-proBNP有更好的診斷心力衰竭的能力，而IGFBP7有更高的能力來判斷心力衰竭的嚴(yán)重程度(Fig.7p, q)。這些結(jié)果表明，從衰竭的心肌細(xì)胞分泌的IGFBP7是一種有用的人類晚期心力衰竭的生物標(biāo)志物。

Fig7 心衰患者的單心肌細(xì)胞RNA-seq和血漿蛋白組分析

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)了一些由衰竭心肌細(xì)胞分泌的與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)的分泌因子。作者證明了心臟成纖維細(xì)胞通過誘導(dǎo)不僅在心臟衰竭的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，心肌細(xì)胞也通過Htra3-TGF-β-IGFBP7軸分泌表型。有利于推動有關(guān)心力衰竭發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)： 

  Ko, T., et al., Cardiac fibroblasts regulate the development of heart failure via Htra3-TGF-beta-IGFBP7 axis. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 3275.