METTL3調控肌肉的維持和生長

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-07-15
目前,對于調節(jié)這種波動同時影響肌肉蛋白質組的轉錄后機制知之甚少。本文報道了在超載誘導應激后骨骼肌肥厚性生長的mRNA m6A動態(tài)的全基因組分析......


骨骼肌的生長是機體健康的基礎。基因表達波動對肌肉穩(wěn)態(tài)和對環(huán)境損害的響應至關重要。但是目前,對于調節(jié)這種波動同時影響肌肉蛋白質組的轉錄后機制知之甚少。本文報道了在超載誘導應激后骨骼肌肥厚性生長的mRNA m6A動態(tài)的全基因組分析。本研究于20221月發(fā)表在《Nature CommunicationsIF14.919期刊上。

 

技術路線:



主要實驗結果:

1、m6A增加和重塑伴隨著骨骼肌肥厚

為確定m6A在骨骼肌肥厚中的作用,作者首先評估了機械過載小鼠中RNA上的m6A修飾水平,發(fā)現(xiàn)相比于對照小鼠,過載肌肉組織的整體m6A水平增加(圖1a-b),且這種增加源于METTL3的表達增加(圖1c-d),表明成年肥厚肌生長期間METTL3-m6A軸整體增強。為深入鑒定肌肉過載后m6A修飾的mRNA,進行了meRIP-seq(圖1e)。雖然轉錄組上的一組核心m6A峰不受肥大刺激的影響,但分析顯示,在1674mRNA上,過載肌肉中m6A的重塑在870個新轉錄本上獲得了1704m6A峰,并且有804mRNA 在適應過載刺激時喪失了1591m6A(圖1f, g)。對轉錄本上m6A位置的分析還發(fā)現(xiàn),這種修飾在mRNA終止密碼子附近富集,在基線和過載條件下,其密度和頻率略有差異(圖1h, i)。對m6A修飾的肌肉轉錄組的GO分析進一步強調了m6A修飾mRNA編碼轉錄調控因子的穩(wěn)定存在,而最豐富的一類超載響應轉錄本是由參與磷酸化依賴細胞信號轉導調控的蛋白編碼的(圖1j, k)。這些數(shù)據暗示了m6A依賴的轉錄后基因調控、轉錄和翻譯后通路之間的相互作用??傊?,這些結果表明,增加的METTL3表達和m6A豐度標志著骨骼肌的肥厚反應,在超負荷誘導肥厚過程中,m6A靶向轉錄組重塑影響特定的酶促肌肉過程。


1 METTL3m6A重構伴隨著肌肉生長

 

2METTL3是適應肥厚肌肉壓力所必須的

為確定METTL3在成人骨骼肌中的作用以及控制其水平的后果,建立了一個肌纖維特異性METTL3功能缺失小鼠模型(METTL3肌肉敲除,M3-mKO)(圖2a)。METTL3缺失效率表現(xiàn)為肌肉中METTL3mRNA水平和蛋白水平均顯著下降(圖2b,c)。這種短期敲除策略不影響小鼠的體重、心臟重量和骨骼肌重量(圖2d-h)。為確定METTL3是否對成年骨骼肌肥大有必要,對M3-mKO小鼠和同窩小鼠進行了肌肉超負荷試驗。在超載14天后,M3-mKO小鼠的跖肌重量未能增加到與WT對照組相同的程度(圖2i)。肌肉細胞大小分析進一步表明,M3-mKO小鼠中,過度負荷引起的肌纖維橫截面增加被消除(圖2j, k)。因此,在骨骼肌對機械負荷的肥厚反應中,METTL3對肌細胞生長至關重要。


2 METTL3是響應肌肉生長所必須的

 

3、增強METTL3通路有利于骨骼肌的生長

證明METTL3對肌肉肥大的必要性引出了一個問題,即增加骨骼肌中METTL3的表達是否足以增強對肌肉超負荷的肥厚反應。為此,構建METTL3過表達質粒(M3-OE)和對照質粒(Ctrl),電轉至小鼠跖肌,隨后對小鼠進行肌肉過載刺激(圖3a)。METTL3過表達后小鼠跖肌中METTL3的表達顯著增加(圖3b),m6A水平顯著增加(圖3c)。令人驚訝的是,METTL3過表達后小鼠跖肌的重量和肌纖維橫截面顯著增加(圖3d-f)。然后,測試了覆蓋METTL3通路是否足以在出生后發(fā)育期間增強骨骼肌生長。為此,將編碼小鼠METTL3或對照病毒載體的腺相關病毒(AAV)注射到出生后第3天的小鼠中(圖3g)。8周后檢測發(fā)現(xiàn),AAV-METTL3組小鼠的METTL3表達,跖肌的重量和肌纖維橫截面顯著增加(圖3h-j),提示METTL3可驅動肥厚響應。最后,探究METTL3是否可以在沒有肥厚觸發(fā)器的情況下驅動肌肉質量的自發(fā)增加。為此,向5個月大的小鼠脛骨前肌注射AAV-METTL3或對照病毒載體(圖3k)。結果顯示脛骨前肌METTL3有效過表達,較高的METTL3含量伴隨著脛骨前肌重量的增加和肌纖維大小的顯著增加(圖3l-n)。


3 METTL3在骨骼肌中是促肥厚的

 

4、METTL3對于骨骼肌的維持和功能是必須的

保持健康的肌肉量對于預防老年人和其它慢性疾病群體的發(fā)病率和死亡率至關重要。為評估METTL3通路的失調是否足以導致肌肉萎縮,進行了一個慢性缺失實驗,將成人肌肉中的METTL3敲除8個月(圖4a)。雖然METTL3敲除對身體或心臟重量沒有顯著影響(圖4b, c),但METTL3的慢性長期缺失導致所有分析的骨骼肌質量下降(圖4d-h)。通過量化脛骨前肌、足底肌和比目魚肌的橫斷肌纖維面積,在細胞水平上證實觀察到的肌肉萎縮(圖4i-l)。為了確定METTL3缺失8個月后觀察到的肌肉損耗的功能后果,進行了體內肌肉扭矩測量,結果顯示METTL3缺失小鼠的跖屈強直性肌肉力下降(圖4m),并且METTL3缺失小鼠在跑步機代謝試驗中進一步表現(xiàn)出跑步性能缺陷和最大耗氧量降低(圖4n, o)??傊?,這些數(shù)據表明,隨著時間的推移,METTL3對于維持肌肉質量和功能是必要的。


4 METTL3的慢性缺失會導致肌肉萎縮

 

5、肌肉m6A-RNA翻譯的METTL3依賴調節(jié)可調控肥厚基因調節(jié)

mRNA上m6A的形成可以通過改變修飾后mRNA的翻譯能力來影響基因的轉錄后表達。為了從機制上理解METTL3如何調節(jié)肌肉大小,在骨骼肌動蛋白啟動子的控制下,將M3-mKO小鼠和野生型對照小鼠與含有RPL22的HA標簽的小鼠雜交,從而分離肌纖維特異性核糖體(圖5a)。首先驗證HA-RPL22的表達(圖5b)。使用HA抗體對從總肌肉提取物中提取的肌纖維核糖體進行免疫沉淀,分析核糖體相關轉錄本,然后對“拉下”mRNA進行測序,作為肌纖維特異性“翻譯體”的代表,與總歸一化mRNA對比(圖5c)。核糖體相關 mRNAs 的生物信息學交叉分析,來自對照肌肉有或沒有 METTL3,與之前由 meRIP-seq 鑒定的所有對照 m6A mRNAs 重疊分析顯示,約39% 的mRNAs經歷 METTL3 依賴性差異翻譯,因而直接靶向METTL3 通路(圖5d)。特別是,在557份差異翻譯轉錄本中(453份富集于WT,加上104份富集于mKO),216份含有m6A(178份富集于WT,加上38份富集于mKO)。對這些重疊轉錄本的GO分析顯示,TGF-β超家族受體是最豐富的(圖5e)。在這類基因中,激活素2型A受體(Acvr2a)是METTL3 KOs肌肉中翻譯增加的典型轉錄本(圖5f)。結果證實,Acvr2a上的m6A修飾是METTL3依賴的(圖5g),肌肉中METTL3的缺失導致Acvr2a mRNA翻譯量增加(圖5h)和Acvr2a蛋白合成量增加(圖5i)。含YTH結構域家族(YTHDF)的RNA結合蛋白是m6A修飾轉錄的關鍵調控因子。YTHDF2可以特異性結合Acvr2a mRNA(圖5j)。YTHDF2有利于相互作用轉錄本的衰減,表明依賴于METTL3的m6A甲基化可能影響Acvr2a的穩(wěn)定性。事實上,METTL3降低了Acvr2a mRNA的穩(wěn)定性(圖5k)。


5 METTL3介導的m6A修飾調節(jié)肌生成抑制素通路

 

6、METTL3通過調控Activin受體的m6A影響TGF-β超家族信號轉導

在肌肉超負荷時,m6A對Acvr2a mRNA的修飾進一步增加(圖6a),表明在應激適應過程中,METTL3對該通路的作用增強。Activin受體激活通過細胞內SMAD3磷酸化發(fā)揮抗肥厚作用。因此,探究了這種翻譯后修飾,發(fā)現(xiàn)METTL3缺陷小鼠在超負荷的肌肉中有異常的SMAD3磷酸化(圖6b)。在METTL3缺陷的肌肉中,抗肥厚性SMAD3的轉錄靶點,如Murf1和Mafbx的表達增加(圖6c, d)。因此,METTL3形成的m6A通過調控Activin受體mRNA翻譯影響TGF-β超家族信號轉導。


6 METTL3通過調控Activin受體的m6A影響TGF-β超家族信號轉導

 

7、Activin受體通路的抑制可挽救METTL3敲除表型

METTL3 介導的 m6A 修飾對 TGF-β 超家族受體的影響突出了 METTL3 作為肌生長抑制素途徑的轉錄后調節(jié)劑的作用。為了證明Activin受體生物學和 METTL3 依賴性肌肉質量調節(jié)之間的因果關系,施用了ACE-031,一種Activin受體配體的抑制劑(即肌肉抑制素,因為這種蛋白質是骨骼肌中這些受體的主要配體)(圖7e)。聯(lián)合給藥肌生長抑制素抑制劑完全拯救了M3-mKO小鼠在14天的肌肉過載后觀察到的受損的肥大生長,在器官水平上通過足底重量和肌纖維水平上通過橫截面積評估(圖7f-h)。


7 METTL3-mKO小鼠的肥大缺陷被肌生長抑制素抑制劑拯救

 

總之,本研究表明,METTL3通過微調激活素受體翻譯影響成人骨骼肌維持、肥厚性生長和功能來調節(jié)肌肉生長(圖7i)。

 

參考文獻:

Petrosino Jennifer M., Hinger Scott A., Golubeva Volha A., Barajas Juan M., Dorn Lisa E., Iyer Chitra C., Sun Hui-Lung., Arnold W David., He Chuan., Accornero Federica.(2022). The mA methyltransferase METTL3 regulates muscle maintenance and growth in mice. Nat Commun, 13(1), 168. doi:10.1038/s41467-021-27848-7