膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抗血管生成治療的靶點(diǎn)-小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腫瘤。研究GBM血管生成的新分子機(jī)制非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，M2小膠質(zhì)細(xì)胞極化與GBM患者微血管密度呈正相關(guān)。M2-膠質(zhì)瘤相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞（GAM）可通過將外泌體circKIF18A轉(zhuǎn)運(yùn)到hBMECs中促進(jìn)GBM的血管生成。在機(jī)制上，circKIF18A可以結(jié)合hBMECs中FOXC2，維持其穩(wěn)定性和核易位。此外，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，FOXC2可以直接與ITGB3、CXCR4和DLL4的啟動(dòng)子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)。此外，FOXC2還可以激活PI3K/AKT信號(hào)，促進(jìn)GBM的血管生成。我們的研究確定了M2-GAM衍生外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2參與GBM血管生成的新分子機(jī)制。這可能為改善GBM抗血管生成治療的療效提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。本文于2022年5月發(fā)表于Oncogene（IF=8.756）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）M2小膠質(zhì)細(xì)胞與GBM患者微血管密度相關(guān)

首先，我們分析了TCGA、CGGA、Rembrandt和Gravendel數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)M2極化標(biāo)記基因（CD163、CD206、ARG1）和血管生成相關(guān)基因（CD31、CD34、vWF）之間存在正相關(guān)（圖1A）?；赥CGA和CGGA數(shù)據(jù)庫的GSEA和GSVA分析表明，CD163高表達(dá)組富含血管生成過程和信號(hào)傳導(dǎo)（圖1B、C）。此外，Kaplan-Meier生存分析表明，在TCGA、Rembrandt和Gravendel數(shù)據(jù)庫中，CD163和CD31高表達(dá)的患者明顯短于CD163和CD31低表達(dá)的患者（圖1D）。隨后，我們采用qPCR、免疫組化等方法檢測(cè)70例膠質(zhì)瘤患者中TMEM119、CD163、CD31的表達(dá)（圖1E）。皮爾遜相關(guān)分析顯示，CD163或TMEM119與CD31或微血管密度（MVD）之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系（圖1F-I）。值得注意的是，CD163和TMEM119高分組的MVD高于低分組（圖1J-L）。Kaplan-Meier生存分析還表明，CD163和CD31表達(dá)較高的膠質(zhì)瘤患者的中位生存時(shí)間短于CD163和CD31表達(dá)較低的膠質(zhì)瘤患者（圖1M）?？傊@些結(jié)果表明，M2小膠質(zhì)細(xì)胞與GBM患者微血管密度呈正相關(guān)。

2）M2小膠質(zhì)源性外泌體在體外和體內(nèi)促進(jìn)血管生成

我們通過qPCR、western blotting和ELISA分析驗(yàn)證原始HMC3的M2極化，M2標(biāo)記物（CD163、CD206、ARG1、IL-6和TGF-β）顯著上調(diào)，M1標(biāo)記物（IL1β和TNF-α）下調(diào)（圖2A-C）。我們分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞來源外泌體（MDE），并通過透射電鏡（TEM）觀察（圖2D）。NTA顯示，室溫下MDE的平均直徑為132 nm（圖2E）。通過western blotting檢測(cè)MDE的標(biāo)記基因（CD9、CD81和TSG101）（圖2F）。此外，PKH26分析表明，HUVEC可以吸收MDEs（圖2G）。我們進(jìn)一步檢測(cè)了M2-MDEs對(duì)hBMECs的直接影響。所有EDU、MTS、transwell、遷移和試管形成分析表明，與GW4869治療組和原始MDEs治療的組相比，M2- MDEs治療后hBMECs的生存能力、侵襲、遷移和試管形成能力都有所提高（圖2H-M）。總之，這些結(jié)果表明M2-MDEs在體外可以促進(jìn)血管生成。

為了進(jìn)一步證實(shí)M2-MDEs能夠促進(jìn)體內(nèi)血管生成，我們構(gòu)建了基于C57BL/6小鼠的同源GBM模型。我們將BV-2 M2或幼稚外泌體注射到GBM荷瘤小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，M2-MDEs治療后的腫瘤體積增大（圖2N，O）。Kaplan-Meier生存分析表明，M2-MDEs治療可比原始MDEs減少中位生存時(shí)間（圖2P）。免疫組織化學(xué)顯示，M2-MDEs治療可以上調(diào)Ki67和CD31的表達(dá)以及MVD（圖2Q，R）。因此，這些結(jié)果表明M2-MDEs在體內(nèi)可促進(jìn)GBM的腫瘤發(fā)生和血管生成。

3）M2-MDEs將circKIF18A運(yùn)輸?shù)?/span>hBMECs中

在HMC3的na?ve和M2-MDEs之間進(jìn)行CircRNA測(cè)序。結(jié)果顯示，有17個(gè)差異表達(dá)的circRNAs。其中，與幼稚MDEs相比，circKIF18A是M2-MDEs中上調(diào)最高的CircRNA（圖3A、B、D）。CircKIF18A是從KIF18A mRNA的轉(zhuǎn)錄本之一反向拼接而成，由其5-14個(gè)外顯子組成。Sanger測(cè)序證實(shí)了頭-尾剪接（圖3C）。瓊脂糖凝膠電泳顯示，cDNA中的發(fā)散引物擴(kuò)增了circKIF18A，但gDNA沒有擴(kuò)增（圖3E）。此外，RNase R處理顯示circKIF18A的表達(dá)略有變化，而其線性RNAs KIF18A明顯減少（圖3F）。FISH分析顯示，circKIF18A主要位于M2 HCM3和hBMECs的細(xì)胞質(zhì)中（圖3G）。此外，qPCR用于檢測(cè)MDEs治療后hBMECs中circKIF18A的表達(dá)，結(jié)果顯示，M2-MDEs治療后circKIF18A的表達(dá)高于幼稚MDEs治療的hBMECs（圖3H）。然后，M2-HMC3中circKIF18A的表達(dá)被敲低或過表達(dá)，并通過qPCR進(jìn)行驗(yàn)證（圖3I）。同樣，在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后，qPCR也顯示circKIF18A-KD M2-MDEs（圖3J）和hBMECs（圖3K）中circKIF18A表達(dá)下調(diào)。然而，circKIF18A-OE M2-MDEs治療后的結(jié)果相反（圖3J，K）?？傊?，這些結(jié)果表明circKIF18A在M2-MDEs中過表達(dá)，并可通過MDEs轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞中。MTS、EDU、transwell、遷移和試管形成分析表明，與陰性對(duì)照（NC）M2-MDEs相比，circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，hBMECs的細(xì)胞活力、增殖、侵襲、遷移、分支數(shù)量和小管長(zhǎng)度均減少（圖3L-P），提示M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A在體外可促進(jìn)血管生成。

4）M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A可直接與FOXC2結(jié)合

由于M2極化與GBM患者微血管密度相關(guān)，我們基于CD163在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)進(jìn)行了GSEA。我們收集了至少在兩條血管生成途徑中起作用的基因，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)重疊基因，包括PTGS2、FLT4、SULF1、FOXC2、NRP1和VEGFA（圖4A，B）。我們進(jìn)一步探討了circKIF18A與hBMECs中這些基因之間可能的分子機(jī)制。qPCR顯示，在hBMECs中，經(jīng)circKIF18A-KD或circKIF18A- OE M2-MDEs治療后，這六個(gè)基因的mRNA表達(dá)沒有持續(xù)變化（圖4C）。然而，WB顯示，在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，VEGFA和FOXC2表達(dá)下調(diào)，而在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，PTGS2、NRP1、FOXC2的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖4D）。因此，F(xiàn)OXC2可能是受circKIF18A調(diào)控的候選基因。根據(jù)catRAPID數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)，circKIF18A可以與FOXC2蛋白結(jié)合，尤其是circKIF18A的Δ291–350區(qū)域與FOXC2蛋白的Δ376–427區(qū)域之間的相互作用位點(diǎn)（圖4E）。RIP分析顯示，抗FOXC2組中circKIF18A的相對(duì)富集度明顯高于IgG治療組。此外，在circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，circKIF18A的富集程度更高，而在circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，circKIF18A的富集程度降低（圖4F）。RNA下拉分析還表明，生物素化的circKIF18A wt探針可以下拉h(huán)BMEsC中的FOXC2，而circKIF18A mt探針不能（圖4G）。此外，將FOXC2 DNA片段克隆到pCMV5質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)染到hBMECs中。RIP分析進(jìn)一步顯示，在pCMV5-Δ376–427組中，circKIF18A的富集程度更高（圖4H）。這些結(jié)果表明，circKIF18A可以直接與FOXC2蛋白結(jié)合。MG-132處理hBMECs后，由circKIF18A-KD M2-MDE引起的FOXC2蛋白表達(dá)減少得到恢復(fù)（圖4I）。CHX分析表明，在hBMECs中，經(jīng)circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，F(xiàn)OXC2蛋白的半衰期縮短，經(jīng)circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，F(xiàn)OXC2蛋白的半衰期延長(zhǎng)（圖4K，L）。此外，在hBMECs中，經(jīng)circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，F(xiàn)OXC2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，幾乎沒有核分布，而經(jīng)circKIF18A-OE M2-MDEs處理后，其核分布明顯增加（圖4M）。CircKIF18A-KD M2-MDEs處理下調(diào)了細(xì)胞核中FOXC2的表達(dá)，而CircKIF18A- OE M2-MDEs處理上調(diào)了細(xì)胞核中FOXC2的表達(dá)（圖4J）。因此，這些結(jié)果表明M2-HMC3通過外泌體circKIF18A誘導(dǎo)FOXC2穩(wěn)定性和核易位。

5）M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A通過FOXC2促進(jìn)體外血管生成

為了進(jìn)一步證實(shí)M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進(jìn)血管生成，hBMECs中FOXC2的表達(dá)被基于慢病毒的RNAi沉默，并且qPCR和WB驗(yàn)證了這些效應(yīng)（圖5A，B）。盡管使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理，MTS、EDU、transwell、migration和tube formation實(shí)驗(yàn)顯示FOXC2敲除后，與陰性對(duì)照組相比，EDU陽性hBMECs的比率、hBMECs的侵襲和遷移數(shù)量、hBMECs的分支數(shù)量和小管長(zhǎng)度均下降（圖5C–G）。因此，這些結(jié)果表明，M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A在體外通過FOXC2促進(jìn)血管生成。

6）M2小膠質(zhì)外泌體circKIF18A可促進(jìn)FOXC2對(duì)ITGB3、CXCR4、DLL4和PI3K/AKT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力

我們根據(jù)Jaspar數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)進(jìn)一步進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告分析和芯片分析（圖6A-D）。結(jié)果表明，在circKIF18A-KD M2-MDEs治療后，pGL3-ITGB3-wt、pGL3-CXCR4-wt和pGL3-DLL4-wt的相對(duì)熒光素酶活性均下調(diào)，而在circKIF18A-OE M2-MDEs治療后，其相對(duì)熒光素酶活性增強(qiáng)（圖6E–J）。芯片分析還表明，在使用circKIF18A-KD M2-MDEs處理后，抗FOXC2可降低hBMECs中ITGB3、CXCR4和DLL4的富集度（圖6K），而在使用circKIF18A-OE M2-MDEs處理后獲得相反的結(jié)果（圖6L）。此外，qPCR和WB也證實(shí)了circKIF18A-KD或circKIF18A-OE M2-MDEs處理后ITGB3、CXCR4和DLL4的表達(dá)水平（圖6M-P）。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXC2可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)促進(jìn)腫瘤的惡性表型。用WB檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)的活性。結(jié)果表明，在hBMECs中，經(jīng)circKIF18A-KD MDEs治療后，p-PI3K、p-AKT和p-MTOR的表達(dá)均下調(diào)（圖6Q），而經(jīng)circKIF18A-OE MDEs治療后，結(jié)果相反（圖6R）。

7）M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成

Mmu_U circ_0009168是小鼠體內(nèi)circKIF18A的同源circRNA。其在BV-2中的過表達(dá)和敲除通過qPCR進(jìn)行驗(yàn)證（圖3E）。然后將mmu_circ_0009168-KD或mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs注射到C57BL/6小鼠的同源GBM模型中。結(jié)果表明，與NC M2-MDEs相比，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后腫瘤體積明顯增大（圖7A，B）。Kaplan-Meier生存分析表明，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs比NC M2-MDEs能縮短中位生存時(shí)間（圖7C）。免疫組織化學(xué)顯示，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治療后，Ki-67、CD31和MVD的表達(dá)增加（圖7D，H）。然而，mmu_circ_0009168-KD M2-MDEs治療后的結(jié)果相反（圖7D-H）。這些結(jié)果表明，M2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體circKIF18A在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成。為了說明我們的發(fā)現(xiàn)，圖7I中的示意圖顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體circKIF18A通過靶向FOXC2促進(jìn)血管生成。

結(jié)論：M2小膠質(zhì)細(xì)胞通過運(yùn)輸外泌體circKIF18A進(jìn)入 hBMECs，促進(jìn)GBM血管生成。從機(jī)制上講，circKIF18A可以結(jié)合hBMECs中FOXC2，維持其穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位。FOXC2可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控ITGB3、CXCR4、DLL4的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路。我們的研究為GBM的抗血管生成治療提供了新的機(jī)制和靶點(diǎn)，這可能會(huì)改善抗血管生成治療的效果。

參考文獻(xiàn)：

Jiang Y, Zhao J, Xu J, Zhang H, Zhou J, Li H, Zhang G, Xu K, Jing Z. Glioblastoma-associated microglia-derived exosomal circKIF18A promotes angiogenesis by targeting FOXC2. Oncogene. 2022;41(26):3461-3473. doi: 10.1038/s41388-022-02360-4.