PCBP1抑制鐵自噬介導(dǎo)的鐵死亡

細(xì)胞質(zhì)中鐵離子分子伴侶PCBP1是一個(gè)多功能的RNA結(jié)合蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄，RNA的調(diào)控，和鐵離子加載至鐵蛋白的過程。PCBP1也是眾所周知的自噬抑制分子，但是PCBP1在鐵自噬和鐵死亡中的作用尚未可知。因此，本研究旨在探究PCBP在鐵自噬介導(dǎo)的鐵死亡在頭頸癌中的作用。本研究于2022年5月發(fā)表在《Redox Biology》IF：11.799期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果

1、PCBP1的表達(dá)和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)

作者通過TCGA分析發(fā)現(xiàn)PCBP1的表達(dá)在正常和HNC腫瘤組織中無差異，但是低表達(dá)PCBP1的患者總體生存率顯著更高。此外，PCBP1低表達(dá)的細(xì)胞對erastin的敏感性更高，表現(xiàn)為在同濃度erastin處理下，PCBP1低表達(dá)的細(xì)胞比PCBP1高表達(dá)細(xì)胞的活力更低、死亡更多、經(jīng)歷脂質(zhì)過氧化的細(xì)胞比例更高、LIP更高（附圖1C-1I）。但是這些作用可以被ferrostatin-1或deferoxamine減緩（附圖1J）。這些結(jié)果表明PCBP1表達(dá)和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)。

附圖1 PCBP1的表達(dá)和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)

2、敲除PCBP1增加HNC細(xì)胞對鐵死亡的敏感性

隨后作者通過PCBP1的功能丟失實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PCBP1與HNC細(xì)胞對鐵死亡敏感性的關(guān)系。在PCBP1高表達(dá)的HN3，HN6，HN12的細(xì)胞中敲除PCBP1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)總鐵和亞鐵含量、LIP、ROS和細(xì)胞死亡均顯著增加，但重新表達(dá)PCBP1可以減輕上述影響（圖1A-1J）。隨著PCBP1的敲除，鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子表達(dá)水平發(fā)生變化，FTH1和FPN表達(dá)下調(diào)，而DMT1和TFRC表達(dá)上調(diào)（圖1K-1L）。這些結(jié)果表明PCBP1敲除通過細(xì)胞內(nèi)亞鐵積累促進(jìn)細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感性。

圖1敲低PCBP1增加HNC細(xì)胞對鐵死亡的敏感性

3、PCBP1負(fù)調(diào)控BECN1 mRNA

PCBP1作為RNA調(diào)節(jié)因子在翻譯過程中起著重要作用。作者通過RBP圖譜分析了BECN1 mRNA的序列，以確定PCBP1的結(jié)合區(qū)域，結(jié)果顯示預(yù)測的PCBP1的結(jié)合區(qū)域位于BECN1 mRNA的3’UTR區(qū)域（圖2A）。用于熒光素酶檢測的BECN1 mRNA片段就是從這一發(fā)現(xiàn)中產(chǎn)生的（圖2B-2C）。隨著pcDNA 3.1-PCBP1的引入，pLFL(全長片段)和pLF2(包括PCBP1結(jié)合區(qū))的熒光素酶活性降低（圖2D）。pull-down驗(yàn)證了PCBP1和BECN1的結(jié)合（圖2E）。以上提示PCBP1負(fù)調(diào)控BECN1 mRNA。

圖2 PCBP1使BECN1 mRNA失去穩(wěn)定性

4、敲除PCBP1增強(qiáng)了鐵自噬誘導(dǎo)性

使用erastin處理的情況下，與對照組比較，PCBP1敲除的細(xì)胞中自噬斑點(diǎn)（及與亞鐵共染斑點(diǎn)）數(shù)量增加、細(xì)胞活力下降、細(xì)胞內(nèi)亞鐵含量增加（圖3A-3C）；此外，PCBP1敲除細(xì)胞中LC3B-II、Atg5和4-HNE表達(dá)增加，而p62、NCOA4和鐵蛋白表達(dá)減少，然而，使用巴菲霉素A1處理細(xì)胞后，LC3B-II和p62表達(dá)增加（圖3D）。PCBP1基因的敲除可顯著增加細(xì)胞中亞鐵含量和共染色點(diǎn)狀體的數(shù)量（圖3E-3F）。這些結(jié)果表明PCBP1阻礙了鐵自噬體的鐵離子釋放。

圖3 敲除PCBP1增強(qiáng)了鐵自噬誘導(dǎo)性

作者此前的研究發(fā)現(xiàn)鐵離子過載進(jìn)入線粒體后會(huì)導(dǎo)致線粒體功能異常。此外，PCBP1敲除后，TMRE顯著下降，線粒體超氧化物和亞鐵染色強(qiáng)度顯著增加（附圖5）。這些研究表明PCBP敲除導(dǎo)致線粒體功能異常是通過增加鐵離子過載進(jìn)入線粒體。

附圖5 鐵自噬引起的鐵離子過載導(dǎo)致線粒體功能異常。

5、PCBP1負(fù)調(diào)控脂質(zhì)過氧化

PCBP1還可以特異性調(diào)控ALOX15的3’端翻譯，ALOX15是氧化生成PUFA的關(guān)鍵分子。因此，作者接下來探究敲除PCBP1是否會(huì)導(dǎo)致氧化PUFA的增加。結(jié)果顯示，敲除PCBP1增加了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、氧化PUFA、游離脂肪酸水平、相關(guān)分子的表達(dá)、MDA和4-HNE水平（附圖6）。當(dāng)細(xì)胞暴露于erastin或sulfasalazine時(shí)，與油酸(10 μM)相比，亞油酸(10 μM)作用時(shí)細(xì)胞活力顯著降低（附圖6F）。在PCBP1敲低的細(xì)胞中，FASN、FADS2、SCD1和SREBP1增加，在PCBP1過表達(dá)的細(xì)胞中減少（附圖6H）。這些結(jié)果表明，敲除PCBP1通過激活脂肪酸合成和ALOX15表達(dá)，促進(jìn)了PUFA的生成和脂質(zhì)過氧化。

附圖6 PCBP1負(fù)調(diào)控脂質(zhì)過氧化

6、PCBP1敲除增加了腫瘤的鐵死亡易感性

最后，作者在體內(nèi)檢測敲除PCBP1是否會(huì)增加鐵死亡易感性。PCBP1-抑制組(HN12 shPCBP1)和PCBP1-過表達(dá)組(HN2 PCBP1質(zhì)粒)的腫瘤生長速度均高于載體對照組（圖4A-4C）。此外，施用sulfasalazine顯著抑制腫瘤生長：在HN12 shPCBP1中更顯著。細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量，脂質(zhì)含量和脂質(zhì)過氧化積累在HN12 shPCBP1腫瘤中更高，并且sulfasalazine處理后更高（圖4D-4F）。在PCBP1抑制或低表達(dá)組中，經(jīng)sulfasalazine處理后ACSL4、ALOX15、4-HNE和PTGS2的表達(dá)增加，而FTH1和NCOA4的表達(dá)降低，但在PCBP1過表達(dá)組則相反（圖4G）。因此，PCBP1敲除有助于體內(nèi)鐵死亡敏感性的增加。

圖4 PCBP1敲除增加了腫瘤的鐵死亡易感性

參考文獻(xiàn)

Lee Jaewang., You Ji Hyeon., Roh Jong-Lyel.(2022). Poly(rC)-binding protein 1 represses ferritinophagy-mediated ferroptosis in head and neck cancer. Redox Biol, 51(undefined), 102276. doi:10.1016/j.redox.2022.102276