lncRNA DDX11-AS1通過與HNRNPC結(jié)合促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，手術(shù)難度大，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。目前，仍然缺乏有效的治療。lncRNA DDX11-AS1已被證明可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，如肝細(xì)胞癌、食管癌等。然而，其在膠質(zhì)瘤中的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中DDX11-AS1的表達(dá)升高，DDX11-AS1高表達(dá)的患者預(yù)后不良。DDX11-AS1是一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志物。在功能上，DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。在機(jī)制上，DDX11-AS1與HNRNPC相互作用，促進(jìn)Wnt /b-catenin和AKT途徑以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。綜上所述， DDX11-AS1/HNRNPC軸可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，這為膠質(zhì)瘤的診斷、治療和預(yù)后提供了新的思路和治療靶點(diǎn)。本文于2022年4月發(fā)表于“Molecular Therapy Nucleic Acids”（IF=8.886）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，高表達(dá)的DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良相關(guān)

為了探索DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)模式，我們?cè)?/span>GEPIA網(wǎng)站上對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析。由于TCGA數(shù)據(jù)中沒有膠質(zhì)瘤對(duì)照組織樣本，通過匹配GTEx數(shù)據(jù)，518例低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和163例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中DDX11-AS1的表達(dá)與207例正常樣本相比顯著增加（圖1A）。隨著級(jí)別的增加，表達(dá)水平也逐漸增加（圖1B）。通過對(duì)GSE4290數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中也高表達(dá)（圖1C）。此外，我們收集了26個(gè)正常樣本和88個(gè)膠質(zhì)瘤，通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行DDX11-AS1定量分析，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)分析一致（圖1D）。根據(jù)DDX11-AS1表達(dá)水平均勻分布所有膠質(zhì)瘤樣本后，我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達(dá)組的總體生存率和無病生存率較高，尤其是在5年內(nèi)（圖1E和1F）?；?/span>TCGA和GTEx膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)的ROC曲線顯示，DDX11-AS1在預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后方面具有較高的準(zhǔn)確性（圖1G）。通過分析CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)，我們還發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達(dá)的患者預(yù)后更好（圖1H）。這些結(jié)果表明，DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展有關(guān)。

2）DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和EMT過程

接下來，我們構(gòu)建了敲低和過表達(dá)的DDX11-AS1細(xì)胞模型，用于細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。通過transwell和傷口愈合實(shí)驗(yàn)，我們觀察到低表達(dá)DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力減弱，而高表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（圖2A和2B）。此外，DDX11-AS1敲除細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)減少（圖2C）。這意味著DDX11-AS1基因敲除抑制了EMT過程；相反，DDX11-AS1過表達(dá)激活了EMT過程（圖2D）。

3）DDX11-AS1增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖能力

為了研究DDX11-AS1對(duì)細(xì)胞增殖的影響，我們進(jìn)行了體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，敲除DDX11-AS1后，T98G和HS683細(xì)胞的增殖能力下降（圖3A）。DDX11-AS1敲除細(xì)胞的集落形成顯著減少，DDX11-AS1高表達(dá)細(xì)胞的集落形成增加（圖3B）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，低表達(dá)DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量增加（圖3C）。此外，我們還進(jìn)行了體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)。我們將DDX11-AS1過表達(dá)的HS683細(xì)胞皮下接種于裸鼠腋窩。腫瘤生長(zhǎng)如圖3D所示。DDX11-AS1過表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度更快。IHC結(jié)果顯示，Ki67在過表達(dá)組的表達(dá)水平增加（圖3E）。由于Wnt/b-catenin和AKT途徑與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。我們通過western blot觀察到DDX11-AS1敲除抑制了這兩條途徑，而過表達(dá)激活了這兩條途徑（圖3F和3G）。IHC分析還顯示，DDX11-AS1組的b-連環(huán)蛋白表達(dá)增加（圖3E）。因此，DDX11-AS1促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。

4）DDX11-AS1與HNRNPC相互作用

越來越多的研究表明，細(xì)胞質(zhì)中lncRNA對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)依賴于蛋白質(zhì)。因此，為了探索DDX11-AS1的潛在結(jié)合蛋白，我們預(yù)測(cè)了DDX11-AS1在starBase v.2.0上的結(jié)合RBP，結(jié)果表明DDX11-AS1可以結(jié)合43個(gè)RBP。此外，收集T98G細(xì)胞，通過RNA純化和質(zhì)譜分析分離染色質(zhì)，鑒定DDX11-AS1結(jié)合的蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，DDX11-AS1特異性結(jié)合208種蛋白質(zhì)。我們主要關(guān)注iBAQ得分前50名的蛋白質(zhì)。在兩組蛋白質(zhì)相交后，只有HNRNPC和PTBP1（圖4A）。由于HNRNPC與DDX11AS1的相互作用更為豐富，HNRNPC被列為后續(xù)機(jī)制研究的候選分子。為了驗(yàn)證DDX11-AS1與HNRNPC的直接結(jié)合，我們使用HNRNPC抗體進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，以拉下與HNRNPC結(jié)合的RNA分子。通過定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)和分析，與IgG Ctrl組相比，HNRNPC抗體顯著富集DDX11-AS1（圖4B）。此外，我們還分析了TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DDX11-AS1和HNRNPC表達(dá)之間的相關(guān)性。DDX11-AS1與HNRNPC呈正相關(guān)（圖4C和4D）。我們還發(fā)現(xiàn)，HNRNPC在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，HNRNPC低表達(dá)的患者預(yù)后更好（圖4E–4G）。通過western blot分析，HNRNPC的表達(dá)隨著DDX11-AS1的敲除而降低，HNRNPC的表達(dá)隨著DDX11-AS1的過表達(dá)而增加（圖4H，4I）。此外，我們構(gòu)建了三個(gè)用于HNRNPC敲除的siRNA，第三個(gè)序列是最好的敲除序列，然后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖4J）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明DDX11-AS1可以特異性結(jié)合HNRNPC。

5）HNRNPC敲除抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT

我們探討了HNRNPC在膠質(zhì)瘤中的功能作用。敲除HNRNPC后，克隆形成實(shí)驗(yàn)表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力下降（圖5A），傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移減少（圖5B）。這些結(jié)果表明，HNRNPC敲除抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，我們還發(fā)現(xiàn)HNRNPC影響Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT過程（圖5C）。

6）DDX11-AS1通過HNRNPC促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展

我們?cè)噲D探討DDX11-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的影響是否依賴于HNRNPC。在過表達(dá)DDX11-AS1的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步敲除HNRNPC進(jìn)行細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)。我們觀察到，通過敲除HNRNPC，DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的能力減弱（圖6A和6B）。此外，我們還分析了DDX11-AS1/HNRNPC軸在體內(nèi)的作用。結(jié)果表明，HNRNPC敲除減弱了DDX11-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用（圖6C）。western blot分析表明，HNRNPC敲除降低了DDX11-AS1介導(dǎo)的Wnt/b-catenin和AKT途徑的激活，以及EMT過程（圖6D）。此外，根據(jù)DDX11-AS1和HNRNPC在CGGA膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)情況，將患者分為四組進(jìn)行總體生存分析。如圖6E所示，DDX11-AS1和HNRNPC低表達(dá)的患者生存率最高。

結(jié)論：DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，并與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)。在機(jī)制上，DDX11-AS1和HNRNPC的結(jié)合增強(qiáng)了Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。DDX11-AS1/HNRNPC軸的發(fā)現(xiàn)有望為膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

Xiang Z, Lv Q, Zhang Y, Chen X, Guo R, Liu S, Peng X. Long non-coding RNA DDX11-AS1 promotes the proliferation and migration of glioma cells by combining with HNRNPC. Mol Ther Nucleic Acids. 2022, 28:601-612. doi: 10.1016/j.omtn.2022.04.016.