空間代謝組——脂質(zhì)組：16.2高分揭示二級(jí)保護(hù)動(dòng)物洞穴魚(yú)的脂質(zhì)代謝進(jìn)化

Sinocyclocheilus 是中國(guó)特有的稀有淡水硬骨魚(yú)屬，包括河棲的地表魚(yú)和洞穴魚(yú)。利用定量脂質(zhì)組和空間質(zhì)譜圖像（MSI）相結(jié)合的方法，本文發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)分布和脂質(zhì)代謝的神經(jīng)區(qū)隔化與Sinocyclocheilus的進(jìn)化有關(guān)。本研究于2022年4月發(fā)表在《Molecular Biology and Evolution》IF：16.240。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究?jī)?nèi)容：

1、洞穴魚(yú)腦內(nèi)氧化磷酸化增加

2016年至2018年在云南省昆明市附近野外捕獲Sinocyclocheilus (2020年被申報(bào)為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物)。在南盤(pán)江沿岸的一個(gè)洞穴中發(fā)現(xiàn)了洞穴魚(yú)品種 S. anophthalmus，而在黃泥河沿岸發(fā)現(xiàn)了地表魚(yú)品種S. anophthalmus（圖1A）。利用之前發(fā)表的全腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用GSEA來(lái)研究這兩個(gè)物種之間KEGG通路的差異。GSEA顯示洞穴魚(yú)腦內(nèi)花生四烯酸(ARA)代謝和氧化磷酸化較地表魚(yú)明顯增強(qiáng)（圖1B）。然后分析了兩個(gè)品種的整個(gè)腦的脂質(zhì)組，PCA顯示洞穴魚(yú)和地表魚(yú)的腦脂質(zhì)組明顯區(qū)分開(kāi)（圖1C）。主要脂類(lèi)的聚類(lèi)熱圖顯示在地表魚(yú)的大腦中復(fù)雜的糖鞘脂豐度顯著升高（圖1D）。為探究脂質(zhì)相關(guān)性的整體改變，對(duì)洞穴魚(yú)和地表魚(yú)的全腦脂質(zhì)組進(jìn)行脂質(zhì)相關(guān)性分析。如圖1E所示，兩個(gè)品種魚(yú)的脂質(zhì)關(guān)聯(lián)發(fā)生明顯改變。

圖1洞穴魚(yú)和地表魚(yú)全腦轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組的變化

2、洞穴魚(yú)和地表魚(yú)的神經(jīng)元表現(xiàn)出相反的DHA和ARA模式

腦切片根據(jù)其沿縱軸的位置分為四個(gè)主要腦區(qū)，即端腦（Tel）、視頂蓋（TeO）、小腦（CC）和延髓（MO）。硬骨動(dòng)物血清素能神經(jīng)元主要分布在后腦中縫核和位于前腦的三個(gè)下丘腦核中，而哺乳動(dòng)物中不存在下丘腦核（圖2A）。定量脂質(zhì)組揭示了地表魚(yú)的整個(gè)大腦的四個(gè)區(qū)域中含有的ARAs膜磷脂都少于洞穴魚(yú)（圖2B-2C）。洞穴魚(yú)中富集的ARAs膜磷脂和前面GSEA的結(jié)果，表明ARA代謝增強(qiáng)。相反，其他脂類(lèi)表現(xiàn)出區(qū)域特異性變化，這只有在區(qū)域特異性脂質(zhì)體組學(xué)中才變得明顯。例如，洞穴魚(yú)的TeO和CC中的?；鈮A水平與地表魚(yú)相比明顯升高（圖2C-2D）。有趣的是，與ARA相反，洞穴魚(yú)的TeO和CC中的自由二十二碳六烯酸(DHA)水平比地表魚(yú)顯著降低（圖2D）。與表面魚(yú)相比，洞穴魚(yú)的 TeO 和 CC 區(qū)域的主要 DHA 磷脂（包括 PC 38:6、PC 40:6 和 PE 40:6）也減少了。

圖2 洞穴魚(yú)和地表魚(yú)四個(gè)腦區(qū)脂質(zhì)的區(qū)域特異性變化

定量脂質(zhì)組學(xué)、MSI的腦切片說(shuō)明 ARA 磷脂，例如 PC 36:4 和 PC 38:4（磷脂酰膽堿，PCs）在 TeO、CC 和 MO 地區(qū)的洞穴魚(yú)切片中持續(xù)增加（圖3）。另一方面，洞穴魚(yú)體內(nèi)的DHA磷脂，如PC 40:6、PC 38:6和PE 40:6，與地表魚(yú)相比明顯減少（圖3）。事實(shí)上，敲除一個(gè)主要的助推超家族成員，Mfsd2a，被證明是DHA通過(guò)血腦屏障進(jìn)入小鼠大腦的轉(zhuǎn)運(yùn)體，導(dǎo)致小腦中的浦kinje細(xì)胞大量丟失（圖3）。因此，DHA可能對(duì)地表魚(yú)的小腦功能至關(guān)重要，而這在洞穴魚(yú)的進(jìn)化中可能不那么重要了。相對(duì)于洞穴魚(yú)，DHA -磷脂的富集延伸到地表魚(yú)的眼睛和肝臟，在地表魚(yú)中，DHA-PCs 的顯著簇含量較高（圖4）。至于 ARA 磷脂，它們?cè)诙囱~(yú)中的富集位于退化視葉的腦室周?chē)疑珔^(qū)域（圖3）。

圖3洞穴魚(yú)和地表魚(yú)四個(gè)腦區(qū)脂質(zhì)空間分布的質(zhì)譜成像

ARA-相對(duì)于 DHA-磷脂的優(yōu)先積累也在洞穴魚(yú)的全眼和全肝樣本中得到驗(yàn)證，相對(duì)于它們的表面棲息對(duì)應(yīng)物（圖4）。ARA包含的磷脂，包括磷脂酰絲氨酸PS 38:4(18:0_20:4)和磷脂酰肌醇PI36:4(16:0_20:4) 都是最顯著不同的脂質(zhì)，其在洞穴魚(yú)眼(CE)中含量高于表面魚(yú)眼(SE)（圖4A）。在洞穴魚(yú)的眼睛和肝臟中，與地表魚(yú)相比，ARA-PC 簇明顯富集（圖4C）。

圖4洞穴魚(yú)和地表魚(yú)全眼和全肝脂質(zhì)的變化

3、穴居魚(yú)的中縫血清素激活的神經(jīng)元發(fā)生脫髓鞘

基于區(qū)域特異性脂質(zhì)組學(xué)，注意到，相對(duì)于洞穴魚(yú)，地表魚(yú)的TeO、CC和MO區(qū)域的硫化物(SLs)顯著升高（圖2B-D）。MSI 顯示，表層魚(yú) TeO中的 SL 富集（SL t42:1、SL t44:1）位于后結(jié)節(jié)，富含來(lái)自上中縫血清素能群體的神經(jīng)元投射（圖 3）。相比之下，相比之下，橫穿下丘腦血清素能神經(jīng)元的 TeO 切片的腦室周?chē)虑鹉X背側(cè)區(qū)沒(méi)有可觀(guān)察到的 SL 信號(hào)，而是富含 DHA 磷脂（PE40:6、PC 40:6 和 PC 38:6)（圖 3）。同樣，在地表魚(yú)相對(duì)于洞穴魚(yú)的CC和MO切片的中間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域觀(guān)察到 SL 富集（圖 3），其中富含下縫血清素能神經(jīng)元的投射。髓磷脂分布的免疫染色，即髓磷脂堿性蛋白的紅色熒光信號(hào)與 MSI 數(shù)據(jù)一致。髓磷脂分布在空間上與SL信號(hào)重疊，對(duì)應(yīng)于CC中下縫血清素能神經(jīng)元和 TeO 上中縫血清素能神經(jīng)元，但在含有下丘腦血清素能神經(jīng)元的背側(cè)腦室周?chē)虑鹉X中沒(méi)有。然后，通過(guò)使用TEM對(duì)軸突髓鞘形成成像來(lái)驗(yàn)證基于脂質(zhì)組學(xué)和免疫染色的觀(guān)察結(jié)果（圖 5）。作者選擇后腦CC區(qū)域做TEM，因?yàn)樵搮^(qū)域主要包含下中縫血清素能神經(jīng)支配，而不是下丘腦血清素能神經(jīng)支配。來(lái)自CC區(qū)域的代表性TEM圖像顯示，相對(duì)于洞穴魚(yú)，在地表魚(yú)視野中捕獲的單個(gè)軸突周?chē)懈嗟乃枨剩▓D 5A），以及較大的軸突周?chē)乃枨屎穸雀螅▓D 5B和5C）。因此，基于MSI、免疫染色和TEM圖像檢查髓鞘形成程度，相對(duì)于洞穴魚(yú)，其似乎主要在地表魚(yú)后腦區(qū)域的中縫血清素能神經(jīng)元群體的髓鞘化程度更高。洞穴魚(yú)的中縫血清素能神經(jīng)元在其進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了明顯的脫髓鞘。免疫染色也顯示，與地表魚(yú)相比，洞穴魚(yú)在 TeO 和 CC 區(qū)域具有更高水平的 5-HT 受體 4 (5-HTR4)（綠色熒光）（圖5D）。這些研究結(jié)果表明，相對(duì)于表面魚(yú)類(lèi)，洞穴魚(yú)在它們的中縫血清素能神經(jīng)元中特別發(fā)生脫髓鞘，但在下丘腦血清素能神經(jīng)元中沒(méi)有。

圖5穴居魚(yú)的中縫血清素激活的神經(jīng)元發(fā)生脫髓鞘

4、魚(yú)類(lèi)大腦和肝臟中環(huán)境特異性代謝適應(yīng)的基因表達(dá)

對(duì)洞穴魚(yú)的大腦、眼睛和肝臟與表面魚(yú)類(lèi)的脂質(zhì)組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)兩種魚(yú)類(lèi)之間脂質(zhì)代謝的四個(gè)本質(zhì)差異，這可能與它們不同棲息地的不同選擇壓力有關(guān)。相對(duì)于地表魚(yú)類(lèi)，洞穴魚(yú)表現(xiàn)出 1) 大腦中的氧化磷酸化增強(qiáng)； 2) DHA-磷脂在大腦、眼睛和肝臟中優(yōu)先于ARA-磷脂的積累； 3) 脂肪（以?xún)?chǔ)存 TAG 的形式）和縮醛磷脂 PC 在肝臟中的積累； (4) 后腦中縫血清素能神經(jīng)元的選擇性脫髓鞘作用。

為了闡明洞穴魚(yú)和表面魚(yú)之間差異脂質(zhì)代謝的候選基因，檢測(cè)了大腦和肝臟中幾個(gè)在 DHA 生物合成、攝取和磷脂重塑、脂肪動(dòng)員、線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體β-氧化以及 plamalogen 途徑的基因表達(dá)。如圖6的qRT-PCR 顯示，在大腦中，DHA 生物合成途徑的fads2的表達(dá)在地表魚(yú)中顯著高于洞穴魚(yú)，但對(duì)于Sprecher途徑上的其他基因（elovl2、elovl5 、mfsd2a和acox1）則不然。相比之下，雖然洞穴魚(yú)和地表魚(yú)的肝臟中 fads2 的水平?jīng)]有顯著差異，但與洞穴魚(yú)相比，地表魚(yú)肝臟中的 Sprecher 途徑的其他基因（elovl2、elovl5 和 acox1）顯著升高。 根據(jù)結(jié)果，地表魚(yú)似乎通過(guò) Δ4 去飽和酶途徑增加大腦中的 DHA 生物合成，但依賴(lài)于 Sprecher 途徑來(lái)增強(qiáng)肝臟中的 DHA 生物合成。 此外，介導(dǎo)DHA從體循環(huán)吸收到大腦的mfsd2a水平在洞穴魚(yú)和水面魚(yú)之間沒(méi)有顯著差異。因此，地表魚(yú)可能保留了局部的 DHA 神經(jīng)供應(yīng)來(lái)維持關(guān)鍵的大腦功能，而不是依賴(lài)于從體循環(huán)中攝取 DHA。

圖6洞穴魚(yú)和水面魚(yú)對(duì)不同棲息地代謝適應(yīng)的大腦和肝臟基因的mRNA表達(dá)

圖7的示意圖總結(jié)了洞穴魚(yú)和地表魚(yú)大腦和肝臟中主要的差異代謝途徑，揭示了它們對(duì)不同環(huán)境的代謝適應(yīng)。除了大腦，洞穴魚(yú)肝臟中的DHA脂質(zhì)也經(jīng)歷了類(lèi)似的減少——肝臟是控制全身脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵器官。與大腦相比，洞穴魚(yú)肝臟中 DHA 生物合成的減少是由于沿 Sprecher 通路的流動(dòng)減弱所致（圖 7）。這一觀(guān)察表明，DHA 生物合成能力的喪失可能在大腦之外具有進(jìn)化意義。

圖7通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)和qRT-PCR，該示意圖總結(jié)了洞穴魚(yú)和地表魚(yú)大腦和肝臟中主要的代謝途徑，揭示了它們對(duì)不同環(huán)境的代謝適應(yīng)

參考文獻(xiàn)：

Lam Sin Man., Li Jie., Sun Huan., Mao Weining., Lu Zongmin., Zhao Qingshuo., Han Chao., Gong Xia., Jiang Binhua., Chua Gek Huey., Zhao Zhenwen., Meng Fanwei., Shui Guanghou.(2022). Quantitative Lipidomics and Spatial MS-Imaging Uncovered Neurological and Systemic Lipid Metabolic Pathways Underlying Troglomorphic Adaptations in Cave-Dwelling Fish. Mol Biol Evol, 39(4), undefined. doi:10.1093/molbev/msac050