炎癥性腸病有“殺手”了，口服益生菌就能治療

炎性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一組可誘發(fā)結(jié)腸和小腸長期炎癥的疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等，這些疾病可能進(jìn)一步誘發(fā)更嚴(yán)重、更致命的疾病，如結(jié)直腸癌。已有研究報道，IBD的病因和發(fā)病機(jī)制與腸道黏膜屏障功能受損和腸道微生態(tài)失調(diào)有關(guān)。然而IBD的臨床醫(yī)學(xué)干預(yù)不能解決炎癥性腸病的根本原因，很多藥物容易引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。本研究旨在解決炎癥性腸病的根本原因，并降低副作用。本文與2022年6月發(fā)表于《Nature Communication》,IF=12.121

本文技術(shù)路線

本文主要內(nèi)容：

1.      工程益生菌治療炎癥性腸病

已有研究表明，殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN- pe[ECN-pE(C/A)2]可以調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腸道菌群豐富度(OTU)和多樣性(Shannon多樣性指數(shù))緩解腸道炎癥。對ECN進(jìn)行基因改造，使其產(chǎn)生能有效清除活性氧的CAT和SOD（Fig 1A）。ECN-pE(C/A)2灌胃小鼠，殼聚糖/海藻酸鈉包裹可顯著提高其胃腸道內(nèi)生物利用度（Fig 1B）。ECN-pE(C/A)2通過消除對炎癥性腸病有顯著的姑息作用，并調(diào)節(jié)腸道菌群（Fig 1C）。     

Fig1 工程益生菌治療炎癥性腸病。

2.殼聚糖/海藻酸鈉包裹的益生菌對胃腸道具有保護(hù)作用

ECN是一種著名的益生菌，考慮到其在臨床中安全使用的悠久歷史，作者選擇了ECN，由于其與當(dāng)前基因操作技術(shù)的兼容性，成為工程表達(dá)不同蛋白質(zhì)的最佳選擇。為了使增加ECN的ROS清除能力，作者利用含有CAT和SOD基因的pET28a-T5載體，通過誘導(dǎo)劑異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)轉(zhuǎn)化ECN，形成CAT和SOD穩(wěn)定表達(dá)的ECN (ECN- pe)。成功構(gòu)建表達(dá)CAT、SOD的ECN。

如圖2a所示，陽離子殼聚糖成功包覆ECN-pE(ECN-pE(C))，zeta電位由37.3 mV上升到5.9 mV，而陰離子海藻酸鈉有效包覆ECN-pE(C/A)的zeta電位下降到36 mV。進(jìn)一步加入殼聚糖后，ECN-pE(C/A)1.5的zeta電位再次變?yōu)?.4 mV。經(jīng)海藻酸鈉進(jìn)一步包覆后，ECN-pE(C/A)2再次呈現(xiàn)負(fù)的zeta電位(38.1 mV)。為了進(jìn)一步證明殼聚糖和海藻酸鈉的成功涂層，作者使用了熒光標(biāo)記殼聚糖和海藻酸鈉，熒光強(qiáng)度也隨著層數(shù)的增加而增加，證實了殼聚糖和海藻酸鈉在ECN-pE上的成功涂層(Fig. 2b)。接下來，研究了不同層殼聚糖/海藻酸鈉對ECN-pE的活力(Fig. 2c)。經(jīng)1 ~ 2層殼聚糖/海藻酸鈉包裹后，ECN-pE仍保持良好的細(xì)胞活性，僅比未包裹的ECN-pE略有降低。但三層包裹明顯降低了細(xì)菌的活力，說明三層包裹可能損害了細(xì)菌的代謝活性。因此，本實驗采用雙層殼聚糖/海藻酸鈉涂層(ECN-pE(C/ a)2)進(jìn)行實驗。此外，殼聚糖/海藻酸鈉涂層對CAT和SOD的表達(dá)也沒有影響（Fig 2d）。之后，檢測了ECN(C/A)2, ECN(C/A)2+IPTG, ECN-pE(C/A)2, 以及ECN-pE(C/A)2 + IPTG的SOD能力。ECN-pE(C/A)2在IPTG作用下表現(xiàn)出較高的SOD活性，O2?清除率達(dá)94%，進(jìn)一步證實ECN-pE(C/A)2在IPTG孵育下能正確生成重組SOD。ECN-pE和ECN-pE(C/A)2在IPTG作用下表現(xiàn)出相似的濃度依賴性SOD催化活性(Fig. 2f)。此外，ECN-pE和ECN-pE(C/A)2在IPTG培養(yǎng)下也表現(xiàn)出類似的過氧化氫分解能力，且呈濃度依賴性，表明重組CAT的合成成功（Fig. 2g, h）。

由圖2I, j可以看出殼聚糖/海藻酸鈉包裹益生菌對胃腸道的保護(hù)作用，在SGF或4%膽鹽孵育2 h后，ECN-pE(C/A)2的形態(tài)完全沒有損傷，而未包裹的ECN-pE則出現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷，這表明雙層殼聚糖/海藻酸鈉包裹對益生菌具有良好的保護(hù)作用胃腸道環(huán)境。為了進(jìn)一步驗證其作用機(jī)制，首先將ECN-pE和ECN-pE(C/A)2置于SGF溶液中孵育。如圖2k所示，ECN-pE暴露于SGF后2 h內(nèi)迅速死亡，而雙層殼聚糖/海藻酸鈉涂層(ECN-pE(C/ a)2)的CFU每毫升僅下降10倍，進(jìn)一步說明了兩層殼聚糖/海藻酸鈉涂層對胃腸道環(huán)境中益生菌的保護(hù)作用。如圖2l-n所示，來自 ECN-lux(C/A)2的生物發(fā)光信號較ECN-lux高5倍， 表明ECN在胃腸道的生存率 經(jīng)殼聚糖/海藻酸鈉包裹后，腸道結(jié)構(gòu)得到了較大的改善。值得注意的是，與未包裹ECN-pE相比，給藥1小時后胃中存活ECN-pE(C/A)2的數(shù)量幾乎高出4倍(Fig. 2o)。更有趣的是，口服ECN-pE后，腸、結(jié)腸和盲腸內(nèi)存活ECN-pE(C/A)2的數(shù)量也明顯高于未包裹的(Fig. 2p–r)。

Fig2殼聚糖/海藻酸鈉包裹的益生菌對胃腸道的保護(hù)作用

3. 殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE可以有效緩解dss誘導(dǎo)的急性IBD

急性IBD C57BL/6小鼠分別用PBS、ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2或ECN- pe治療，在此過程中，所有IBD小鼠都飲用含有IPTG (1 mM)的飲用水，誘導(dǎo)CAT和SOD的持續(xù)表達(dá)(Fig. 3a)。與對照組(PBS + 3% DSS)相比，ECN-pE(C/A)2處理對DSS誘導(dǎo)的IBD有明顯的保護(hù)作用，包括體重減輕、結(jié)腸長度縮短和結(jié)腸組織損傷。相比之下，ECN-pE不能完全緩解小鼠體重減輕和DAI升高，因為ECN-pE在沒有殼聚糖/海藻酸鈉包裹的情況下生物利用度較低(Fig. 3b–h)。此外，ECN(C/A)2處理的小鼠由于缺乏CAT和SOD的表達(dá)，也表現(xiàn)出明顯的體重下降和結(jié)腸長度縮短(Fig. 3b, e)。CN-pE(C/A)2處理的小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分較低，與對照組(PBS+水)接近，上皮完整，指狀隱泡結(jié)構(gòu)規(guī)則，炎癥細(xì)胞比例較低，表明ECN-pE(C/A)2能顯著促進(jìn)結(jié)腸組織的修復(fù)。ECN(C/A)2處理的小鼠結(jié)腸組織病理組織學(xué)評分較高，與DSS處理組(PBS + 3% DSS)接近，隱窩變形完全，杯狀細(xì)胞嚴(yán)重丟失，炎癥細(xì)胞浸潤明顯（Fig. 3g, h）。由于缺乏殼聚糖/海藻酸鈉涂層保護(hù)，ECN-pE只能部分緩解小鼠結(jié)腸組織損傷。此外，ECNpE小鼠結(jié)腸中ibd相關(guān)的MPO活性(C/A)2處理也顯著下降，表明ECN-pE(C/A)2能有效緩解氧化應(yīng)激，緩解IBD (Fig. 3i)。采用ELISA法檢測典型促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)的水平。如圖3j-l所示，IL-1β、DSS處理小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6顯著上調(diào)?？寡准?xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10 (IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)的水平相應(yīng)上調(diào)， 進(jìn)一步證明ECN-pE(C/A)2(Fig 3m, n)具有良好的抗炎作用。綜上所述，殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE表達(dá)CAT和SOD，可以有效緩解dss誘導(dǎo)的急性IBD。

Fig 3殼聚糖/海藻酸鈉包裹ECN-pE可以有效緩解dss誘導(dǎo)的急性IBD

4. ECN-pE(C/A)2對不同小鼠IBD模型均表現(xiàn)出良好的治療效果。

然后，作者研究了ECN-pE(C/A)2對結(jié)腸上皮細(xì)胞和受損的結(jié)腸上皮屏障的影響，這是dss誘導(dǎo)的急性IBD32的關(guān)鍵特征。根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果(Fig. 4a, b, d, e)。與ECN-pE相比，ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2處理均能有效上調(diào)結(jié)腸組織中ZO-1和Occludin的表達(dá)，進(jìn)一步說明抗氧化酶(CAT和SOD) 和殼聚糖/海藻酸鈉涂層在結(jié)腸上皮修復(fù)中的作用的關(guān)鍵作用。此外，F(xiàn)ITC -右旋糖酐灌注試驗也用于評估結(jié)腸通透性。與dss處理的小鼠相比，ECN-pE(C/A)2處理的小鼠血清中fitc -右旋糖酐信號明顯降低，表明DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠中腸屏障修復(fù)(Fig. 3f)。ECN-pE(C/A)2處理顯著緩解結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡水平，與健康小鼠的凋亡水平非常接近(Fig 4C.4F)。為了評估其安全性，作者進(jìn)行了多項指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)ECN-pE(C/A)2處理各項指標(biāo)與健康小鼠無明顯差別(Fig. 4g)。

Fig 4 ECN-pE(C/A)2對不同小鼠IBD模型均表現(xiàn)出良好的治療效果

5. ECN-pE(C/A)2對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

作者研究了ECN-pE(C/A)2對抗生素預(yù)處理的dsd小鼠急性IBD的治療效果。經(jīng)抗生素預(yù)處理后ECN-pE(C/A)2的治療效果明顯降低，提示腸道菌群可能在急性IBD的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Fig. 5a-g)。因此，作者進(jìn)一步研究了ECN-pE(C/A)2是否可以調(diào)節(jié)dss誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中腸道菌群的豐度。然后，通過16S rRNA基因測序分析腸道菌群豐度，結(jié)果表明口服ECN-pE(C/A)2能顯著改變dss處理小鼠腸道菌群豐度和多樣性(Fig. 5h, i)。此外， ECN-pE(C/A)2處理之后，健康組和DSS處理組小鼠 Escherichiashigella (一個能促進(jìn)炎癥性腸病致命的病原體) 的相對豐度降低(Fig. 5j–n)。

Fig 5 ECN-pE(C/A)2在IBD治療期間調(diào)節(jié)腸道菌群

6. ECN-pE(C/A)2對IBD具有緩解作用

為了進(jìn)一步探討ECN-pE(C/A)2對IBD延遲治療的療效，作者研究ECN-pE(C/A)2對IBD延遲治療的療效。建立C57BL/6小鼠急性IBD之后，在第5、6、7、9天進(jìn)行ECN(C/A)2、ECN- pe (C/A)2或ECN- pe小鼠灌喂(Fig. 6a)。值得注意的是，ECN-pE(C/A)2治療有效地保護(hù)小鼠免受dss誘導(dǎo)的急性IBD，包括結(jié)腸長度縮短、體重減輕、結(jié)腸上皮組織損傷和MPO活性增加 (Fig. 6b–g)。此外，ECN-pE(C/A)2處理還能抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的水平，并且上調(diào)抗炎細(xì)胞因子水平(Fig. 6h–l)。這些結(jié)果驗證了ECN-pE(C/A)2對dss誘導(dǎo)的急性IBD具有明顯的延緩緩解作用。

Fig 6 ECN-pE(C/A)2對IBD具有緩解作用

本研究表明，在小鼠模型中口服具有生物膜自我涂層的基因工程益生菌可以有效地調(diào)節(jié)炎癥和腸道菌群，緩解急性結(jié)腸炎。鑒于腸道菌群失調(diào)和腸道炎癥與許多其他系統(tǒng)性疾病高度相關(guān)，益生菌基因工程結(jié)合功能性表面涂層可能為許多其他疾病的治療提供方便和有益的平臺。

參考文獻(xiàn)：

Zhou, J., et al., Programmable probiotics modulate inflammation and gut microbiota for inflammatory bowel disease treatment after effective oral delivery. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 3432.