44分——ceRNA機制的正反饋環(huán)
大量研究表明circRNA和m6A甲基化修飾參與了包括肝細胞癌（HCC）在內的多種惡性腫瘤的病理進展和轉移。但是circRNA如何和m6A甲基化修飾形成發(fā)聵環(huán)作用于HCC進展尚不清楚。本研究證實circGPR137B通過circGPR137B/miR-4739/FTO反饋環(huán)促進HCC的腫瘤發(fā)生和轉移。這種通過circRNA和m6a修飾事件之間的功能耦合執(zhí)行的正反饋機制為表觀遺傳學提供了一種新的模型機制。本研究于2022年6月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。
技術路線
主要實驗結果：
1、circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關
對3對HCC腫瘤組織和配對癌旁組織進行測序，其差異表達circRNA熱圖如圖1A所示，在P < 0.05和FC > 1.5的標準篩選后，在HCC中得到96個上調和51個下調的circRNA（圖1B）。火山圖顯示hsa_circ_0017114，一個來源于線性RNA GPR137B的circRNA，在HCC中顯著下調表達，將其命名為circGPR137B（圖1C）。circRNA表達譜和RT-qPCR均表明相比于癌旁組織circGPR137B在HCC中下調（圖1D-1E）。隨后在87對HCC和癌旁組織中進一步證實了這個結果（圖1F-1G）。預后分析發(fā)現(xiàn)和circGPR137B高表達組比較，circGPR137B低表達組具有較差的生存預后（圖1H-1I）。以上結果表明circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關。
圖1 circGPR137B下調和HCC患者的不良預后相關
hsa_circ_0017114來源于14q1(q42.3)染色體上GPR137B的外顯子1，7區(qū)域，命名為circGPR137B，其基因組序列是40204nt，剪切長度是1537nt（圖2A）。HepG2和Hep3B細胞在RNase R中暴露2小時，發(fā)現(xiàn)GPR137B的表達顯著下降而circGPR137B的表達因其抗性而無明顯改變（圖2B）。隨后探究了circGPR137B在actinomycin D暴露中的穩(wěn)定性，結果顯示circGPR137B的半衰期顯著長于GPR137B（圖2C）。RT-qPCR和FISH實驗表明HCC組織中circGPR137B主要定位于染色質（圖2D-2E）。
圖2 HCC細胞中circGPR137B的特征
3、在體外circGPR137B抑制HCC細胞的生長和侵襲
作者檢測了6株HCC細胞系中circGPR137B的表達，結果發(fā)現(xiàn)與正常肝細胞系比較，其在SK-hep-1細胞系中表達最高，在Hep3B中的表達最低（圖3A）。所以后續(xù)在SK-hep-1細胞系中進行circGPR137B的敲低實驗，在Hep3B中進行circGPR137B過表達實驗（圖3B）。MTT，集落形成和Transwell實驗顯示circGPR137B過表達HCC細胞的生長和侵襲，circGPR137B敲低則效果相反（圖3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中發(fā)揮抑癌作用。
圖3在體外CircGPR137B抑制細胞生長
4、在HCC中miR-4739的表達和circGPR137B負相關和HCC不良預后相關
基于circRNA表達譜和miRbase在線預測發(fā)現(xiàn)circGPR137B擁有5個潛在結合的miRNA（圖4A），它們的結合位點如圖4B所示。雙熒光素酶實驗結果顯示circGPR137B的熒光素酶活性只在miR-4739 mimics處理時顯著降低而非另外4個miRNA（圖4C）。FISH結果顯示相比于癌旁組織miR-4739的表達在HCC中顯著上調（圖4D-4E），并且miR-4739表達和circGPR137B顯著負相關（圖4F）。TCGA數(shù)據(jù)也證實miR-4739表達在HCC中顯著上調，且和不良預后相關（圖4G-4H）。以上說明HCC中miR-4739高表達且預示不良預后。
圖4 在HCC中CircGPR137B與miR-4739呈負相關
5、在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿
基于上述結果作者選擇miR-4739用于進一步實驗。過表達circGPR137B顯著降低miR-4739的表達（圖5B）。此外，野生型circGPR137B和miR-4739的結合位點如圖5A所示，同時構建了結合位點突變的circGPR137B熒光素酶報告基因載體。結果顯示在野生型中，circGPR137B的熒光素酶活性在miR-4739過表達組顯著降低，但是miR-4739突變后不改變，此外，在circGPR137B突變體中，miR-4739過表達不影響circGPR137B的熒光素酶活性（圖5C）。AGO2-RIP顯示和對照組比較內源性circGPR137B和miR-4739的富集可被Ago2抗體拉下（圖5D）。FISH分析發(fā)現(xiàn)circGPR137B和miR-4739具有明顯的細胞質共定位（圖5E）。此外，細胞功能實驗表明miR-4739過表達可顯著抵消circGPR137B過表達對HepG2和Hep3B細胞增殖和侵襲的抑制效果（圖5F-5G）。這些結果表明在HCC中circGPR137B可靶向調控miR-4739。
圖5 在HCC中circGPR137B是miR-4739的海綿
6、在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO
根據(jù)TargetScan7.1的結果，F(xiàn)TO可能是miR-4739的靶基因（圖6A）。熒光素酶實驗證實FTO和miR-4739可相互結合（圖5B），并且miR-4739過表達可顯著降低FTO，p21，p27，caspase-3/9和E-cadherin的表達，升高N-cadherin和vimentin的表達（圖6C-6D）。此外，miR-4739過表達也可逆轉circGPR137B對上述基因表達的影響。共轉染FTO質粒和miR-4739 mimics后可觀察到FTO過表達顯著阻止了miR-4739過表達帶來的促腫瘤作用（圖6E-6G）。這些結果提示在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO。
圖6 在HCC中circGPR137B/miR-4739軸上調FTO
隨后作者分析了FTO在HCC中的表達模式和預后價值，結果和預期一致，F(xiàn)TO表達在HCC組織中顯著下降，且FTO下調與HCC預后不良有關（圖7）。
圖7 FTO下調提示HCC預后不良
7、FTO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路
此前有研究表明腫瘤中circRNA會發(fā)生m6A修飾，而FTO是去甲基化酶，所以作者猜想FTO是通過介導circGPR137B的m6A修飾參與HCC進展。在HepG2和Hep3B細胞中，過表達FTO均可顯著降低總體的m6A水平（圖8A-8B）以及circGPR137B的m6A水平（圖8C），但顯著增加了circGPR137B的表達水平（圖8D）。敲低FTO則降低circGPR137B的表達（圖8E）。此外，敲低circGPR137B的表達也可顯著增加miR-4739的表達增加FTO的表達（圖8F），而miR-4739抑制劑處理則增加FTO的表達（圖8G）。RIP實驗揭示FTO可以結合circGPR137B（圖8H）。重要的是，敲低circGPR137B可顯著逆轉FTO過表達引起的抗腫瘤效果（圖8I-8J）。以上說明，F(xiàn)TO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路調控HCC進展。
圖8 FTO介導circGPR137B的m6A修飾與circGPR137B形成正反饋環(huán)路
8、在體內circGPR137B抑制HCC腫瘤發(fā)生和轉移
如圖9和圖10所示，過表達circGPR137B顯著增加HCC腫瘤的體積和重量，促進病理性改變，增加腫瘤增殖和FTO表達，同時也顯著促進HCC細胞的肺轉移結節(jié)形成，而敲低circGPR137B表達則效果完全相反。表明在體內circGPR137B抑制HCC腫瘤發(fā)生和轉移。
圖10 CircGPR137B抑制體內HCC的肺轉移
綜上所述，本研究證實circGPR137B通過正反饋回路抑制肝癌的增殖和轉移。CircGPR137B 通過海綿吸附 miR-4739 誘導 FTO表達。FTO蛋白進入細胞核介導circGPR137B的m6A去甲基化并促進其表達，因此，對circGPR137B 產生形成正反饋，從而強烈抑制肝癌細胞增殖、集落形成、侵襲和肺遷移。
圖11本研究的機制模擬圖
參考文獻：
Liu Lianyong., Gu Mingjun., Ma Junhua., Wang Ying., Li Miao., Wang Hui., Yin Xin., Li Xiangqi.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 21(1), 149. doi:10.1186/s12943-022-01619-4