MARCKSL1–2-改善肺腺癌化療的靶點(diǎn)

lncRNAs與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)。在我們之前的研究中，我們證明HDAC1/4介導(dǎo)的miR-200b沉默增強(qiáng)了人肺腺癌（LAD）細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇（DTX）的耐藥性。在此，我們探討了LncRNA MARCKSL1–2在LAD細(xì)胞DTX抗性中的作用。我們發(fā)現(xiàn)在DTX抗性的LAD細(xì)胞中，MARCKSL1–2表達(dá)顯著降低。MARCKSL1–2抑制親代和DTX抗性的LAD細(xì)胞的生長(zhǎng)和DTX耐藥性。此外，我們發(fā)現(xiàn)，MARCKSL1–2通過(guò)增加miR-200b表達(dá)和抑制HDAC1在LAD中發(fā)揮作用。從機(jī)制上講，MARCSKL1–2將SUZ12招募到HDAC1的啟動(dòng)子，以加強(qiáng)HDAC1啟動(dòng)子的H3K27me3，從而降低HDAC1的表達(dá)。MARCKSL1–2通過(guò)阻斷HDAC1對(duì)miR-200b啟動(dòng)子組蛋白乙?；揎椀囊种谱饔蒙险{(diào)miR-200 b。小鼠異種移植腫瘤模型的體內(nèi)分析表明MARCKSL1–2的過(guò)表達(dá)減弱LAD腫瘤中的DTX抗性。本文于2022年7月發(fā)表于Molecular Cancer（IF=41.444）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MARCKSL1-2的下調(diào)與LAD患者的DTX耐藥性和不良預(yù)后相關(guān)

根據(jù)腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)，將60例LAD組織分為DTX不敏感組（SD+PD）和敏感組（CR+PR）。有趣的是，RT-qPCR數(shù)據(jù)表明，與敏感組相比，不敏感LAD組織中的MARCKSL1–2水平顯著下調(diào)（圖1a）。此外，腫瘤組織中的MARCKSL1–2水平低于正常肺組織中的水平（圖1b）。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，較低的MARCKSL1–2水平與LAD患者的PFS和OS較短相關(guān)（圖1c-d）?；谏鲜鰯?shù)據(jù)，我們?cè)u(píng)估了MARCKSL1–2與LAD細(xì)胞中DTX抗性的相關(guān)性。RT-qPCR揭示，與親代細(xì)胞相比，耐DTX的LAD細(xì)胞中的MARCKSL1-2水平顯著下降（圖1e），表明MARCKSL1-2與人類LAD細(xì)胞的耐DTX相關(guān)。在探索其功能之前，我們分析了MARCKSL1–2的細(xì)胞分布。數(shù)據(jù)顯示MARCKSL1–2主要存在于細(xì)胞核中（圖1f-g）。類似地，F(xiàn)ISH圖像表明，MARCKSL1–2的染色主要在細(xì)胞核中，抗性細(xì)胞中觀察到的MARCKSL1–2信號(hào)少于親代細(xì)胞（圖1h）。這些結(jié)果表明，MARCKSL1–2在DTX抗性的LAD細(xì)胞中低水平表達(dá)。

2）MARCKSL1-2對(duì)DTX處理下耐DTX或敏感LAD細(xì)胞行為的影響

為了確定MARCKSL1–2在LAD細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們沉默了H1299和SPC-A1細(xì)胞中的MARCKSL2表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了H129P/DTX和SPC-A1/DTX細(xì)胞中的MARCKSL1–2表達(dá)。當(dāng)MARCKSL1–2在H1299和SPC-A1細(xì)胞中沉默時(shí)，增殖能力明顯增強(qiáng)。相反，MARCKSL1–2的過(guò)表達(dá)阻礙了H1299/DTX和SPC-A1/DTX細(xì)胞的增殖（圖2a-d）。此外，流式細(xì)胞儀和TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，5、10 μg/L DTX作用下，缺失MARCKSL1-2可降低H1299和SPC-A1細(xì)胞的凋亡率，而上調(diào)MARCKSL1-2可誘導(dǎo)0、50、100 μg/L DTX作用下H1299/DTX和SPC-A1/DTX細(xì)胞的凋亡率（圖2e-h）。這些結(jié)果表明，MARCKSL1–2在DTX敏感和耐藥LAD細(xì)胞中均起到生長(zhǎng)抑制作用。

3）MARCKSL1-2通過(guò)調(diào)節(jié)HDAC1和miR-200b減輕LAD細(xì)胞的DTX抗性

我們先前的研究表明，HDAC1/4和miR200b參與LAD細(xì)胞的DTX抗性。在此，我們研究了MARCKSL1–2是否可以調(diào)節(jié)HDAC1/4和miR-200以降低DTX抗性。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)MARCKSL1–2在親代和DTX抗性LAD細(xì)胞中負(fù)調(diào)節(jié)HDAC1，正調(diào)節(jié)miR-200b（圖3a-d）。由于MARCKSL1–2主要分布在LAD細(xì)胞的細(xì)胞核中，我們?cè)u(píng)估了MARCKSL2–2對(duì)HDAC1和miR-200b轉(zhuǎn)錄的影響。來(lái)自熒光素酶報(bào)告分析的數(shù)據(jù)顯示，在H1299和SPC-A1細(xì)胞中，MARCKSL1-2敲低后miR-200b啟動(dòng)子熒光素酶強(qiáng)度降低，而在H1299/DTX和SPC-A1/DTX細(xì)胞中，MARCKSL1-2上調(diào)后miR-200b啟動(dòng)子熒光素酶強(qiáng)度升高（圖3e）。相反，在所示細(xì)胞中，HDAC1啟動(dòng)子的熒光素酶活性顯示出與miR-200b啟動(dòng)子相反的趨勢(shì)（圖3f）。更重要的是，經(jīng)驗(yàn)證，通過(guò)HDAC1干擾或miR-200b模擬，可以抵消由MARCKSL1–2敲除誘導(dǎo)的DTX IC50值的增強(qiáng)，并且在HDAC1過(guò)表達(dá)或miR-200b抑制的情況下，由MARCSKL1–2過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的DTX的IC50值降低得以恢復(fù)（圖3g，j）?？傊?，MARCKSL1–2通過(guò)抑制HDAC1或升高miR-200b來(lái)減弱LAD細(xì)胞中的DTX抗性。

4）MARCKSL1-2在LAD細(xì)胞中招募SUZ12

根據(jù)先前的報(bào)告，HDAC1/4缺失可以通過(guò)維持miR-200b啟動(dòng)子處的組蛋白H3乙?；瘉?lái)提高miR-200b的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)LAD細(xì)胞的DTX抗性?；诖?，我們假設(shè)MARCKSL1–2可以通過(guò)增強(qiáng)miR-200b啟動(dòng)子處的組蛋白H3乙?；絹?lái)抑制HDAC1上調(diào)miR-200b。芯片分析顯示，MARCKSL1–2的減少抑制，而其上調(diào)增強(qiáng)了miR-200b啟動(dòng)子的組蛋白-H3乙?；剑▓D4a-b）。接下來(lái)，我們探討了MARCKSL1–2影響HDAC1轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。我們采用RNA下拉和銀染色來(lái)分析與MARCKSL1-2相互作用的潛在蛋白質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)SUZ12與MARCKSL1-2以高結(jié)合分?jǐn)?shù)相互作用（圖4c）。此外，我們證實(shí)了SUZ12在親代和DTX抗性LAD細(xì)胞中的MARCKSL1–2下拉復(fù)合物中的存在（圖4d）。同時(shí)，RIP數(shù)據(jù)顯示，MARCKSL1–2在抗SUZ12組中高度富集，其在DTX抗性LAD細(xì)胞中的富集程度高于親本細(xì)胞（圖4e-f）。此外，我們檢測(cè)了MARCKSL1–2對(duì)SUZ12 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的影響。結(jié)果表明，MARCKSL1–2不能影響不同LAD細(xì)胞中SUZ12的表達(dá)（圖4g-h）。這些結(jié)果表明，MARCKSL1–2在親代和DTX抗性LAD細(xì)胞中與SUZ12相互作用。

5）MARCKSL1-2通過(guò)招募SUZ12到HDAC1啟動(dòng)子來(lái)影響 HDAC1的表達(dá)

SUZ12是PRC2復(fù)合物的關(guān)鍵亞單位，其調(diào)節(jié)靶基因的H3K27甲基化。因此，我們進(jìn)一步探討了MARCKSL1–2是否通過(guò)招募SUZ12來(lái)調(diào)節(jié)HDAC1轉(zhuǎn)錄。我們首先分析了SUZ12對(duì)HDAC1的影響。我們發(fā)現(xiàn)SUZ12上調(diào)降低了SPC-A1和H1299細(xì)胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平，而SUZ12的缺失導(dǎo)致H1299/DTX和SPCA1/DTX細(xì)胞中HDAC1水平升高（圖5a-b）。隨后，ChIP檢測(cè)顯示，HDAC1啟動(dòng)子在親本和DTX耐藥LAD細(xì)胞SUZ12組均富集，且DTX耐藥細(xì)胞中HDAC1啟動(dòng)子的富集量低于親本細(xì)胞(圖5c-d)。此外，HDAC1啟動(dòng)子中的H3K27me3水平因SUZ12上調(diào)而增強(qiáng)，而在SUZ12下調(diào)時(shí)降低（圖5g）。更有趣的是，在SPC-A1和H1299細(xì)胞中，MARCKSL1–2敲除明顯減少了SUZ12組中HDAC1啟動(dòng)子的富集，而在SPC-A1/DTX和H1299/DTX細(xì)胞中，當(dāng)MARCKSL1–2上調(diào)時(shí)，HDAC1啟動(dòng)子的富集增強(qiáng)（圖5f-g）。在MARCKSL1–2干擾下，HDAC1啟動(dòng)子中的H3K27me3水平降低，但在MARCKSL1–2過(guò)表達(dá)時(shí)增加（圖5h）。這些結(jié)果表明，MARCKSL1–2通過(guò)招募SUZ12誘導(dǎo)HDAC1啟動(dòng)子處的H3K27me3修飾來(lái)阻礙HDAC1的表達(dá)。

6）MARCKSL1-2通過(guò)調(diào)節(jié)HDAC1/miR-200b軸影響LAD細(xì)胞的DTX抗性

接下來(lái)，我們測(cè)試了MARCKSL1–2是否通過(guò)調(diào)節(jié)HDAC1和miR-200b來(lái)調(diào)節(jié)LAD細(xì)胞的DTX抗性。我們進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)。集落形成和EdU分析的結(jié)果顯示，MARCKSL1–2敲除提高了H1299和SPC-A1細(xì)胞的增殖能力，并且在HDAC1抑制或miR-200b模擬下，升高的增殖被徹底逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，在HDAC1上調(diào)或miR-200b抑制的情況下，受MARCKSL1–2上調(diào)阻礙的H1299/DTX和SPC-A1/DTX細(xì)胞的增殖能力完全恢復(fù)（圖6a-d）。流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL分析的數(shù)據(jù)顯示，HDAC1敲低或miR-200b模擬可挽救因MARCKSL1-2缺失而對(duì)LAD細(xì)胞凋亡的抑制作用。相反，HDAC1過(guò)表達(dá)或miR-200b抑制完全消除了MARCKSL1-2上調(diào)對(duì)DTX抗性LAD細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用（圖6e-h）。這些結(jié)果表明，MARCKSL1–2通過(guò)調(diào)節(jié)HDAC1/miR-200b軸減輕LAD細(xì)胞的DTX抗性。

7）MARCKSL1-2在體內(nèi)減輕LAD腫瘤的DTX抗性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MARCKSL1–2在體內(nèi)DTX耐藥性中的意義，我們構(gòu)建了小鼠模型，并觀察了不同治療下小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況。與對(duì)照組相比，MARCKSL1–2過(guò)表達(dá)或DTX治療組的腫瘤大小、體積和重量更小，并且在DTX治療的組中，MARCSKL1–2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致上述參數(shù)進(jìn)一步降低（圖7a-c）。因此， MARCKSL1–2在體內(nèi)增強(qiáng)了LAD細(xì)胞對(duì)DTX治療的敏感性。

結(jié)論：我們的研究闡明了MARCKSL1–2/SUZ12/HDAC1/miR-200b軸在LAD細(xì)胞生長(zhǎng)和DTX抗性中的抑制作用，表明MARCKSL2–2可能是改善LAD患者化療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Jiang M, Qi F, Zhang K, Zhang X, Ma J, Xia S, Chen L, Yu Z, Chen J, Chen D. MARCKSL1-2 reverses docetaxel-resistance of lung adenocarcinoma cells by recruiting SUZ12 to suppress HDAC1 and elevate miR-200b. Mol Cancer. 2022 Jul 21;21(1):150. doi: 10.1186/s12943-022-01605-w.