腸道生物失調(diào)促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展和多西他賽耐藥

據(jù)報(bào)道，腸道菌群參與了各種人類惡性腫瘤的進(jìn)展和化療耐藥性。本研究旨在初步闡明腸道生態(tài)失調(diào)與前列腺癌的關(guān)系。首先，我們發(fā)現(xiàn)使用廣譜抗生素干擾腸道菌群可以促進(jìn)小鼠皮下和原位腫瘤的生長。糞便菌群移植可傳遞抗生素暴露對(duì)腫瘤生長的影響。然后，對(duì)小鼠糞便的16S rRNA測(cè)序表明，Proteobacteria在抗生素處理后的相對(duì)豐度顯著升高。同時(shí)，隨著腸通透性的升高，瘤內(nèi)脂多糖(LPS)含量顯著增加。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均顯示，腫瘤內(nèi)LPS激活NF-κB-IL6-STAT3軸促進(jìn)前列腺癌增殖和多西他賽化療耐藥。最后，通過對(duì)患者糞便樣本的16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中Proteobacteria富集，與血漿IL6水平、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)。ROC曲線顯示，Proteobacteria的相對(duì)豐度在預(yù)測(cè)前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移概率方面優(yōu)于前列腺特異性抗原水平?？傊@項(xiàng)研究證明了腸道失衡，其特征是由于抗生素暴露導(dǎo)致變形桿菌的富集，導(dǎo)致腸道通透性和瘤內(nèi)LPS的提高，通過NF-κB-IL6-STAT3軸促進(jìn)小鼠前列腺癌的發(fā)展。本研究于2022年6月發(fā)布于“Microbiome”（IF=16.837）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）抗生素處理促進(jìn)前列腺癌生長

通過口服抗生素建立小鼠腸道生態(tài)紊亂模型。C57BL/6J小鼠連續(xù)灌胃加廣譜抗生素的水，包括氨芐西林、粘菌素、新霉素、萬古霉素(以下簡(jiǎn)稱Abx)，隨后用RM-1(小鼠CRPC細(xì)胞系)進(jìn)行前列腺癌腫瘤移植(圖1A)。飼養(yǎng)4-5周后，與陰性對(duì)照組(NC)相比，抗生素干預(yù)有效增加了皮下腫瘤體積和體重(圖1B)。在原位移植腫瘤中也觀察到了同樣的結(jié)果(圖1C)。此外，為了確定腸道菌群是否對(duì)其負(fù)責(zé)，我們進(jìn)行了FMT(圖1D)。結(jié)果顯示，與FMT-NC組相比，F(xiàn)MT-Abx組皮下腫瘤體積和腫瘤重量增加(圖1E)。腫瘤組織免疫組化分析顯示，Abx和FMT-Abx組Ki-67陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量上調(diào)(圖1F)。這些結(jié)果表明，抗生素處理促進(jìn)小鼠前列腺癌的生長，這與擾亂腸道菌群有關(guān)。

2）變形桿菌在抗生素處理后顯著富集

為研究小鼠腸道菌群組成，收集Abx組、FMT-Abx組、NC組和FMT-NC組小鼠糞便樣本，進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。結(jié)果顯示Abx和FMT-Abx組以及NC和FMT-NC組之間存在相似的細(xì)菌群落組成(圖2A)。接下來，在不同的分類水平上評(píng)估四個(gè)組的腸道菌群概況。我們發(fā)現(xiàn)，在門水平上，Bacteroidetes和Firmicutes的相對(duì)豐度在NC和FMT-NC組中占優(yōu)勢(shì)，而Proteobacteria的相對(duì)豐度在Abx和FMT-Abx組中顯著富集(圖2B)。在科水平上，Abx和FMT-Abx組的Muribaculaceae和Lachnospiraceae明顯減少(圖2C)。我們發(fā)現(xiàn)Proteobacteria在Abx和FMT-Abx組中得分最高(圖2D)?？傊股仫@著改變了腸道細(xì)菌群落的組成。變形菌門的相對(duì)豐度顯著增加，這被認(rèn)為是腸道生態(tài)失調(diào)的標(biāo)志。

3）瘤內(nèi)LPS激活NF-κB-IL6-STAT3軸

根據(jù)前述測(cè)序結(jié)果，我們假設(shè)腸道失衡(以Proteobacteria的富集為特征)破壞了腸道屏障，LPS被釋放進(jìn)入循環(huán)，到達(dá)腫瘤。為了證明這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示NC組的糞便中LPS水平明顯高于Abx組，但血清中LPS水平與Abx組相反。此外，Abx組結(jié)腸也有一定程度的損傷(圖3A)。Abx組的腫瘤中LPS明顯增加(圖3B)。接著，我們采用大腸桿菌重組LPS進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。我們發(fā)現(xiàn)IL6的相對(duì)倍數(shù)變化明顯高于其他細(xì)胞因子。隨后，ELISA檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞上清中IL6蛋白水平也顯著升高(圖3C)。我們通過RPPA發(fā)現(xiàn)IL6與p-STAT3 (Tyr705)呈正相關(guān)，GSEA顯示JAK-STAT通路上調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-STAT3與p-p65的表達(dá)水平呈正相關(guān)(補(bǔ)充圖，未展示)。相應(yīng)地，我們發(fā)現(xiàn)p-p65和p-STAT3在LPS作用下在RM-1細(xì)胞核中增加(圖3D)，并且在體外呈劑量依賴性(圖3E)。在p65磷酸化抑制劑的存在下，IL6的轉(zhuǎn)錄水平降低，p-p65和p-STAT3的蛋白水平也降低。為了進(jìn)一步證實(shí)IL6的作用和作用方式，我們通過收集LPS培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞上清，建立條件培養(yǎng)基(CM)。與CM相比，在CM中加入IL6抗體后p-STAT3減弱(圖3E)。與此相一致的是，通過ELISA檢測(cè)，與NC組相比，Abx組腫瘤組織裂解液和血清中IL6的濃度升高。通過western blot和免疫組化分析，p-p65和p-STAT3也得到了相同的結(jié)果(圖3F, G)。總之，在腸道通透性上調(diào)的情況下，瘤內(nèi)LPS升高，并在腸道失衡小鼠中激活NF-κB-IL6-STAT3軸。

4）IL6-STAT3通路促進(jìn)前列腺癌增殖

IL6-STAT3通路已被證實(shí)能夠促進(jìn)多種惡性腫瘤的進(jìn)展。我們選擇RM-1和DU-145(人CRPC細(xì)胞系)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。與上述結(jié)果一致的是，western blot結(jié)果顯示，在CM培養(yǎng)的細(xì)胞中，p-STAT3升高，而在STAT3磷酸化抑制劑存在時(shí)，p-STAT3降低。STAT3下游增殖相關(guān)基因，如cyclin D1和c-myc，在RM-1和DU-145中都發(fā)生了相應(yīng)的改變(圖4A)。同時(shí)，采用Edu檢測(cè)法和克隆形成法檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞體外增殖能力，結(jié)果表明抑制IL6-STAT3通路可抑制前列腺癌細(xì)胞系增殖(圖4B, C)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與Abx組相比，Abx+Stattic組腫瘤體積和重量顯著降低(圖4D)。腫瘤組織免疫組化分析顯示，與NC組相比，Abx組中p-STAT3、cyclin D1、c-myc增強(qiáng)，而Abx+ Stattic組中p-STAT3、cyclin D1、c-myc降低(圖4E)。

5）IL6-STAT3通路促進(jìn)前列腺癌多西他賽耐藥

多西他賽作為CRPC的一線治療手段，在臨床上不可避免地會(huì)導(dǎo)致耐藥，其潛在機(jī)制之一可能是IL6-STAT3通路的激活。兩株細(xì)胞RM-1和DU-145在空白、CM單獨(dú)和CM加Stattic三種條件下培養(yǎng)24 h。在上述處理之后，我們將多西他賽添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。Western blot結(jié)果顯示，來自CM培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞中p-STAT3增加，但使用Stattic后降低。有趣的是，多西他賽治療可能會(huì)增加這些水平(圖5A)。細(xì)胞活力和TUNEL實(shí)驗(yàn)表明，抑制IL6-STAT3通路可以改善前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐受性(圖5B, C)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。多西他賽能顯著降低正常喂養(yǎng)小鼠的腫瘤體積和體重，但對(duì)腸道生態(tài)失調(diào)小鼠沒有效果。然而，聯(lián)合使用多西他賽和Stattic可顯著降低腫瘤體積和重量(圖5D)。腫瘤組織免疫組化分析顯示p-STAT3、Bcl-2、survivin發(fā)生相應(yīng)變化(圖5E)。這些結(jié)果表明，IL6-STAT3通路在腸道失衡小鼠腫瘤中被激活，促進(jìn)前列腺癌的增殖和多西他賽耐藥。

6）患者的臨床特征和腸道菌群特征

了解腸道菌群對(duì)前列腺癌進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的影響需要從臨床患者樣本中獲得進(jìn)一步的證據(jù)。本研究招募了良性前列腺增生(BPH)、非轉(zhuǎn)移性前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者。對(duì)患者糞便樣本進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)三組之間的α-和β-多樣性無顯著差異(圖6A、B)。值得注意的是，在門水平上的細(xì)菌組成表明，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的Proteobacteria相對(duì)豐度高于非轉(zhuǎn)移性前列腺癌或BPH患者，并且在前列腺癌和BPH患者之間也存在差異(圖6C)。Proteobacteria的相對(duì)豐度與血漿IL6水平、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀況呈正相關(guān)(圖6D)。ROC曲線顯示，雖然Proteobacteria不能區(qū)分前列腺癌和BPH，但它在預(yù)測(cè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面比PSA水平更有潛力(圖6E)。

結(jié)論：抗生素有效促進(jìn)前列腺癌的生長，這是由腸道菌群介導(dǎo)的。抗生素處理后，Proteobacteria的相對(duì)豐度較高，且隨著腸通透性升高，瘤內(nèi)LPS增加，通過NF-κB-IL6-STAT3軸在前列腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，變形桿菌可能被用作進(jìn)展性前列腺癌的腸道生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

Zhong W, Wu K, Long Z, Zhou X, Zhong C, Wang S, Lai H, Guo Y, Lv D, Lu J, Mao X. Gut dysbiosis promotes prostate cancer progression and docetaxel resistance via activating NF-κB-IL6-STAT3 axis. Microbiome. 2022 Jun 16;10(1):94. doi: 10.1186/s40168-022-01289-w.