國自然熱點之m7G:METTL1/WDR4介導(dǎo)的tRNA m7G修飾調(diào)控mRNA翻譯驅(qū)動頭頸部鱗癌
N7 -甲基鳥苷(m7G)是一種最常見的RNA表觀修飾，常位于真核生物mRNA的5’帽和內(nèi)部位置，或所有物種的rRNA和tRNA內(nèi)部。m7G修飾通過影響各種RNA分子的代謝，包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖體RNA。越來越多的證據(jù)表明，m7G在人類疾病的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前m7G中標(biāo)的項目越來越多，但又不會像其他熱點一樣被研究的很泛濫，因此不失為基金申請的好方向。下圖為22年部分m7G中標(biāo)項目的題目：
那么，如何在課題中引入和研究m7G修飾呢？下面，我們通過一篇最新高分文章解讀來了解。
癌細胞選擇性地促進致癌轉(zhuǎn)錄物的翻譯以刺激癌癥進展。盡管越來越多的證據(jù)表明tRNA修飾和相關(guān)基因參與了這一過程，但它們在頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)中的作用在很大程度上仍未得到表征。在這里，作者試圖研究轉(zhuǎn)移RNA(tRNA) N7-甲基鳥苷(m7G)修飾在調(diào)節(jié)HNSCC發(fā)生和發(fā)展中的功能和機制。該研究于2022年3月發(fā)表在《Cancer Communications》，IF：15.283。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. METTL1和WDR4上調(diào)并與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
分析m7G tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物組分METTL1和WDR4的表達水平，發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4在HNSCC中顯著上調(diào)并呈正相關(guān)(r=0.53) (圖1A和B)。METTL1或WDR4高表達的患者總生存期(OS)較短(圖1C)。為進一步驗證，作者對140個HNSCC組織和69個正常組織進行免疫組化(IHC)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4主要在細胞核中表達，HNSCC組織中METTL1和WDR4的表達水平顯著高于正常組織(圖1D和E)。METTL1或WDR4蛋白高表達的患者的OS短于METTL1或WDR4蛋白低表達的患者(圖1F)。在這些HNSCC組織中也發(fā)現(xiàn)了METTL1和WDR4表達水平之間存在顯著相關(guān)性(圖1G)。通過Western blotting和qRT-PCR證實METTL1和WDR4在HNSCC組織中的顯著高表達，并且根據(jù)anti-m7G Northwestern blotting，HNSCC組織中的m7G修飾水平相應(yīng)高于相鄰正常組織中的修飾水平(圖1H和I)。因此，作者推測METTL1和WDR4可能與HNSCC進展有關(guān)，并與HNSCC患者的預(yù)后不良有關(guān)。
圖1. METTL1和WDR4上調(diào)并與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
2. HNSCC在體外和體內(nèi)的進展都需要METTL1/WDR4
檢測了5個HNSCC細胞系中的METTL1表達水平，發(fā)現(xiàn)所有HNSCC細胞系的METTL1蛋白水平均高于HOK細胞(圖2A)。在SCC9和SCC15細胞系中使用sgRNA敲除METTL1基因(圖2B)，發(fā)現(xiàn)敲除SCC9和SCC15細胞中的METTL1可抑制細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成并促進細胞凋亡(圖2C-G)。細胞周期分析顯示，與METTL1-WT組相比，METTL1-KO組G1期細胞百分比顯著增加(圖2H)。使用原位移植模型進一步研究了METTL1在體內(nèi)的致癌功能。METTL1-KO細胞形成的腫瘤生長較慢，腫瘤體積明顯小于METTL1-WT細胞形成的腫瘤(圖2I和J)。IHC染色顯示敲除METTL1導(dǎo)致泛細胞角蛋白(PCK)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LN)顯著減少(圖2K)?？傮w而言，數(shù)據(jù)表明METTL1和WDR4在HNSCC的進展和轉(zhuǎn)移中充當(dāng)癌基因。
圖2. METTL1是HNSCC在體外和體內(nèi)進展所必需的
3. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)HNSCC中的mRNA翻譯和PI3K/AKT/mTOR信號通路
為探究METTL1調(diào)節(jié)HNSCC進展的機制，首先檢測了METTL1-KO或敲低WDR4細胞中的tRNA m7G信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除METTL1或敲除WDR4導(dǎo)致tRNA m7G修飾水平降低(圖3A)。利用TRAC-seq分析了SCC15細胞中全局m7G tRNA修飾的單核苷酸分辨率圖譜。在tRNA的V環(huán)內(nèi)共鑒定出16個含有m7G修飾的HNSCC和“RRGGYYS”基序的tRNA(圖3B和C)。與METTL1-WT組相比，METTL1-KO顯著降低了已鑒定tRNA的m7G tRNA修飾水平(圖3D和E)。非m7G修飾的tRNA水平?jīng)]有顯著改變，但大多數(shù)m7G修飾的tRNA表達水平降低(圖3F和G)。Northern blotting證實m7G修飾的tRNA(如ValACC和ThrTGT)的表達水平降低，而未修飾的tRNA(ProAGG)的表達水平保持不變(圖3H）。多核糖體分析結(jié)果表明，METTL1敲除導(dǎo)致多核糖體峰減少，表明METTL1-KO細胞中的全局翻譯受到抑制(圖3I)。嘌呤霉素攝取試驗表明，嘌呤霉素在METTL1-KO細胞中的摻入顯著減少(圖3J)。接著作者進行了挽救實驗，發(fā)現(xiàn)野生型METTL1(但不是催化失活突變體)的過表達挽救了METTL1-KO細胞中受損的mRNA翻譯(圖3K)。核糖體足印結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL1的缺失增加了m7G tRNA的密碼子依賴性核糖體暫停(圖3L)，表明METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾對于m7G tRNA解碼密碼子的核糖體轉(zhuǎn)換過程中的有效密碼子識別是必要的。密碼子頻率分析顯示，翻譯效率(TE)降低的mRNA具有顯著更高的m7G修飾tRNA解碼密碼子頻率(圖3M)。
為確定METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾的下游mRNA靶標(biāo)，作者進行RNC-seq以研究主動翻譯的mRNA，并鑒定了3945個減少翻譯的mRNAs和2172個增加翻譯的mRNAs(圖4A)。KEGG富集分析和GSEA顯示PI3K/AKT/mTOR信號通路在METTL1調(diào)控的基因中持續(xù)富集(圖4B和C)。Western blotting結(jié)果表明，METTL1-KO細胞中的PI3K蛋白水平以及AKT和mTOR的磷酸化水平顯著降低(圖4D)。進一步檢測了下游蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)在METTL1-KO細胞中，Cyclin D1、Vimentin、MMP9、Bcl-2和P-S6K的表達顯著降低，而BAX的表達顯著上調(diào)(圖4D)。此外，qRT-PCR分析表明，敲除METTL1幾乎不影響PIK3CA的轉(zhuǎn)錄，但顯著降低了PIK3CA的翻譯(圖4E)。通過過表達PIK3CA或在METTL1-KO細胞中用AKT激活劑SC79處理進行了拯救實驗，發(fā)現(xiàn)這兩種方法都部分逆轉(zhuǎn)了敲除METTL1對HNSCC細胞的影響(圖4F-I)。
圖3. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)HNSCC中的tRNA表達和mRNA翻譯
圖4. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性
4. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實Mettl1-PI3K/Akt/mTOR是HNSCC致癌和轉(zhuǎn)移所必需的
為探索Mettl1在自發(fā)HNSCC中的作用，作者生成了Mettl1cKO-Ctrl和Mettl1cKO小鼠，能夠特異性地敲除小鼠口腔上皮中的Mettl1表達。用4NQO治療小鼠16周以發(fā)展為HNSCC，然后在12周后實施安樂死以收集它們的舌頭和頸部淋巴結(jié)。首先通過IHC染色驗證了Mettl1在口腔上皮中的敲除效率(圖5A)。與Mettl1cKO-Ctrl小鼠相比，Mettl1cKO小鼠出現(xiàn)的臨床可見病變更少且更小(圖5B)。Mettl1cKO-Ctrl和Mettl1cKO小鼠的可見病變數(shù)量分別為3.7±0.3和2.8±0.2(圖5C)。此外，Mettl1cKO小鼠的組織病理學(xué)分級低于Mettl1cKO-Ctrl小鼠(圖5D)。Mettl1cKO小鼠在病變中表現(xiàn)出更強的抑制增殖能力(Ki67)和更低的轉(zhuǎn)移能力(PCK、LN) (圖5E和F)。用4NQO治療Mettl1cKI和Mettl1cKI-Ctrl小鼠以促進HNSCC的發(fā)展。IHC染色顯示Mettl1cKI小鼠的上皮細胞表現(xiàn)出比Mettl1cKI-Ctrl小鼠更強的Mettl1陽性信號(圖5G)。定量分析顯示，Mettl1cKI小鼠出現(xiàn)更多病變，病變面積更大(圖5H和I)。來自Mettl1cKI小鼠的腫瘤比來自Mettl1cKI-Ctrl小鼠的腫瘤具有更高的組織病理學(xué)分級和更高的增殖和轉(zhuǎn)移能力(圖5J-L)。
為進一步了解Mettl1如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)HNSCC進展和轉(zhuǎn)移，從兩對Mettl1cKO和Mettl1cKO-Ctrl小鼠中收集了HNSCC組織，并使用10X Genomics Chromium平臺進行了scRNA-seq。經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾，總共獲得18,665個單細胞轉(zhuǎn)錄組。進一步的無監(jiān)督聚類確定了HNSCC上皮細胞以及基質(zhì)亞型，包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、肌肉細胞、骨髓細胞、B細胞和T細胞(圖6A)。重新聚集上皮細胞，發(fā)現(xiàn)與Mettl1cKO-Ctrl小鼠相比，Mettl1cKO小鼠中的Mettl1基因下調(diào)(圖6B和C)。此外，上皮細胞GSVA的結(jié)果顯示，在Mettl1cKO HNSCC樣本中PI3K/Akt活化顯著降低(圖6D)。用抗HA抗體免疫沉淀mRNA從舌病變中翻譯出來，發(fā)現(xiàn)與在K14CreER;RiboTag;Mettl1wt/wt小鼠中相比，在K14CreER;RiboTag;Mettl1fl/fl小鼠中Pik3ca基因的表達降低(圖6E)。用BKM120治療的Mettl1cKI小鼠出現(xiàn)更少的病變，病變面積減少，浸潤性癌減少，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移減少(圖6F-H)。
圖5. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實Mettl1是HNSCC致癌和轉(zhuǎn)移所必需的
圖6. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實Mettl1調(diào)節(jié)HNSCC中的PI3K/Akt/mTOR活性
5. 敲除Mettl1后HNSCC微環(huán)境改變的scRNA-seq分析
腫瘤浸潤性骨髓細胞是HNSCC微環(huán)境的重要組成部分。分析scRNA-seq數(shù)據(jù)以進一步檢查敲除Mettl1后HNSCC中免疫細胞的情況?？偣舶l(fā)現(xiàn)471個骨髓細胞，它們被分為7個亞群：中性粒細胞、C-X3-C基序趨化因子受體1(Cx3cr1+)巨噬細胞、甘露糖受體C1型(Mrc1+)巨噬細胞、巨噬細胞-3(Macro-3)細胞、樹突狀細胞、朗格漢斯細胞和遷移細胞。值得注意的是，與Mettl1cKO-Ctrl相比，Mettl1cKO HNSCC中的Mrc1+巨噬細胞、Macro-3細胞和朗格漢斯細胞的比例升高(圖7A-C)。此外，確定了總共1,013個腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，它們被聚集成七個不同的亞群，分別是CD4記憶T、CD4+幼稚T、CD4+T耗竭、CD8+初始T、自然殺傷細胞(NKT)、T輔助17(Th17)和調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞(圖7D-F)。量化每個亞簇的細胞數(shù)量和比例，發(fā)現(xiàn)Mettl1cKO HNSCC樣本中的CD4+T耗竭和Treg顯著減少(圖7E)。如圖7G所示，在Mettl1cKO HNSCC樣本中發(fā)現(xiàn)了多個受體-配體對的抑制作用，包括白細胞介素1β(Il1b)-白細胞介素1受體2型(Il1r2)和Il1b-腎上腺素受體2(Adrb2)。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細胞中Mettl1的敲除導(dǎo)致癌細胞與其微環(huán)境之間的通訊發(fā)生改變。
圖7. 敲除Mettl1后HNSCC腫瘤中腫瘤細胞-微環(huán)境串?dāng)_的scRNA-seq分析
結(jié)論：
作者發(fā)現(xiàn)tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1通過調(diào)節(jié)整體mRNA翻譯(包括PI3K/AKT/mTOR信號通路)促進HNSCC的發(fā)展和惡性，并改變HNSCC的免疫景觀。METTL1可能是HNSCC患者的一個有希望的治療靶點。