線粒體和鐵死亡——GPD2協(xié)同線粒體GPX4抵御鐵死亡

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-11-21
本研究通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPX4抑制劑處理后導(dǎo)致細(xì)胞中的甘油(G3P)丟失。進(jìn)一步研究大小補(bǔ)充G3P的癌細(xì)胞......


我們對細(xì)胞器抵御鐵死亡的機(jī)制了解甚少,這阻礙了我們在疾病治療中通過靶向鐵死亡達(dá)到治療目的。本研究通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPX4抑制劑處理后導(dǎo)致細(xì)胞中的甘油(G3P)丟失。進(jìn)一步研究大小補(bǔ)充G3P的癌細(xì)胞以G3P脫氫酶2 (GPD2)依賴的方式減弱由GPX4抑制劑誘導(dǎo)的鐵死亡,GPD2缺失使得癌細(xì)胞對GPX4抑制引起的線粒體脂質(zhì)過氧化和鐵死亡敏感,并且GPX4GPD2同時敲低能協(xié)同抑制鐵死亡引起的腫瘤生長。這些結(jié)果表明GPD2參與線粒體抵御鐵死亡。本研究于20226月發(fā)表在《Proc Natl Acad Sci USAIF12.779期刊上。

 

技術(shù)路線:


 

主要實驗結(jié)果:

1、代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPD2與鐵死亡調(diào)控關(guān)聯(lián)

GXP4急性失活即用GPX4抑制劑處理后的2小時來挖掘鐵死亡的抵御機(jī)制。代謝組分析發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞用GPX4抑制劑(RSL3,ML210,ML162)處理2小時后 C-Asp,一種嘧啶生物合成的中間產(chǎn)物,是最顯著下調(diào)的,此外還發(fā)現(xiàn)G3P也在3種抑制劑處理的癌細(xì)胞中顯著下降了(圖1A-D)。而G3P補(bǔ)充顯著抑制RSL3誘導(dǎo)的不同癌細(xì)胞系的鐵死亡(圖1E)。這表明G3P具有抵御GPX4失活引起的鐵死亡的能力。

于是進(jìn)一步探究G3P關(guān)聯(lián)鐵死亡調(diào)控的代謝酶,如圖1F所示,線粒體內(nèi)膜結(jié)合的GPD2G3P轉(zhuǎn)換回DAP,并將電子傳遞給線粒體中的電子傳遞鏈。Cancer Therapeutics Response PortalCTRP)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)GPD2的表達(dá)而非GPD1,GPD1LGK,PGP與細(xì)胞對GOX4抑制劑抗性相關(guān)(圖1G-H)。因此,后續(xù)研究關(guān)注GPD2。


1代謝組分析發(fā)現(xiàn)GPD2與鐵死亡調(diào)控關(guān)聯(lián)

 

2、GPD2敲除促進(jìn)GPX4失活誘導(dǎo)的鐵死亡

為了探究GPD2在鐵死亡調(diào)控中的作用,采用CRISPR-Cas9方法分別在宮頸癌HeLa細(xì)胞,皮膚癌RPMI7951細(xì)胞,和大腸癌HCT116中敲低GPD2的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPD2敲低不影響基底細(xì)胞活力但使得這些癌細(xì)胞對GOX4抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化敏感(圖1J-1S)。在HeLa和RPMI7951細(xì)胞中,細(xì)胞死亡被鐵死亡抑制劑ferrostatin-1或鐵螯合劑(DFO)完全抑制,證實這些GPX4抑制劑誘導(dǎo)了這些細(xì)胞系的鐵死亡(圖1K, L, N, O),然而HCT116細(xì)胞在用ferrostatin-1或DFO處理后仍有殘留死亡(圖1M, P),表明這些GPX4抑制劑主要觸發(fā)鐵死亡,但也可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的其他非鐵死亡的細(xì)胞死亡。此外,GPD2缺失似乎不影響GPX4、FSP1、dhdh、SLC7A11、ACSL4等其他鐵死亡調(diào)控因子的表達(dá)(圖1I)。最后,研究顯示G3P抵御RSL3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用被GPD2敲除所廢止(圖1T-W)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明G3P通過GPD2和GPD2缺乏使細(xì)胞對GPX4抑制引發(fā)的鐵死亡敏感保護(hù)細(xì)胞免受GPX4抑制引起的鐵死亡。


2 GPD2敲除促進(jìn)GPX4失活誘導(dǎo)的鐵死亡

 

3、GPD2抑制線粒體脂質(zhì)過氧化

GPD2是定位在線粒體內(nèi)膜上的酶。分級分析證實了內(nèi)源性GPD2在幾種癌細(xì)胞系中的線粒體定位(圖3A)。與此前的研究一直,MitoPerOx染色顯示RSL3處理不導(dǎo)致強(qiáng)烈的線粒體脂質(zhì)過氧化,重要的是,GPD2敲低顯著增強(qiáng)RSL3處理下的線粒體脂質(zhì)過氧化(圖3B-E)。野生型GPD2在GPD2敲除細(xì)胞中的恢復(fù),而不是其線粒體定位缺陷的突變體(42AA),挽救了GPD2缺陷對RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和線粒體脂質(zhì)過氧化的影響(圖3A,F(xiàn)-L)。此外,在GPD2野生型細(xì)胞中,使用自由基捕獲抗氧化劑TEMPO或ferrostatin-1處理完全抑制了RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,但使用Mito-TEMPO不能提供任何保護(hù)作用(圖3M-P)。相反,在GPD2-KO細(xì)胞中,Mito-TEMPO和ferrostatin-1及TEMPO的作用類似,可以完全抑制RSL3誘導(dǎo)的線粒體脂質(zhì)過氧化(圖3Q-S),并顯著抑制細(xì)胞死亡(圖3T-W)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明GPD2抑制線粒體脂質(zhì)過氧化,而RSL3在GPD2缺陷細(xì)胞中誘導(dǎo)的鐵死亡至少部分是由線粒體脂質(zhì)過氧化引發(fā)的。


3 GPD2抑制線粒體脂質(zhì)過氧化

 

4在線粒體中GPD2通過還原CoQCoQH2抑制鐵死亡

接下來探究GPD2抑制線粒體脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的機(jī)制。分析發(fā)現(xiàn)GOD2敲除使細(xì)胞對GOX4抑制劑RSL3和ML210敏感(圖2J-P),但是對另一種鐵死亡抑制劑FIN56,其可耗竭CoQ和GPX4(圖4A-D)。由于GPX4抑制劑和FIN56之間的主要區(qū)別在于它們對CoQ耗盡的影響不同,這些數(shù)據(jù)表明GPD2以CoQ依賴的方式抑制鐵死亡(例如,當(dāng)CoQ被FIN56耗盡時,GPD2敲除對鐵死亡的作用就減弱了)。與此一致,作者發(fā)現(xiàn)在用4-氯苯甲酸(4CBA)處理阻斷CoQ合成的條件下, GPD2敲除的鐵死亡敏感效應(yīng)被消除(圖4E-F)。同樣地,COQ2缺失消除了GPD2缺失對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感作用(圖4G-H)。這些結(jié)果與已知的CoQ抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡作用相符。在線粒體內(nèi)膜中,GPD2將G3P氧化為DAP,并將CoQ還原為CoQH2(圖1F)。作者證實GPD2敲除導(dǎo)致HeLa 和HCT116e細(xì)胞中CoQ/CoQH2比例顯著增加(圖4I-J)。此外,補(bǔ)充MitoQH2(線粒體靶向CoQH2)完全抑制了RSL3處理的GPD敲除細(xì)胞的線粒體脂質(zhì)過氧化(圖4K-M)并廢除了GPD2導(dǎo)致的鐵死亡敏感性(圖4N-P)。這些數(shù)據(jù)表明在線粒體中GPD2通過還原CoQ至CoQH2抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。

近來的研究表明,F(xiàn)SP1和DHODH分別通過在質(zhì)膜和線粒體中產(chǎn)生CoQH2來抑制鐵死亡。因此,作者進(jìn)一步探究GPD2與DHODH或FSP1在調(diào)控鐵死亡中的相互作用。過表達(dá)DHODH而非FSP1,可以顯著挽救GOD2缺失細(xì)胞的鐵死亡敏感表型(圖4Q-R),此外,GPD2過表達(dá)可以部分挽救DHODH缺失細(xì)胞的鐵死亡敏感表型(圖4U-V)。GPD2 與線粒體中的 DHODH 并行運(yùn)行,但不與質(zhì)膜上的 FSP1 并行運(yùn)行,以防止鐵死亡。


4在線粒體中GPD2通過還原CoQCoQH2抑制鐵死亡

 

5、在體外細(xì)胞模型中GPD2與線粒體GPX4協(xié)同作用抑制鐵死亡

上述結(jié)果促使作者繼續(xù)研究鐵死亡調(diào)控中GPD2和GPX4互作。為此,利用CRISPR-Cas9方法構(gòu)建了GPD2和GPX4單敲除(KO)和雙敲除(DKO)的HCT116細(xì)胞(圖5A)。研究顯示GPX4-KO HCT116細(xì)胞在無ferrostatin-1培養(yǎng)基中長時間培養(yǎng)(14 ~ 15 d)后完全死亡(圖5B)。GPD2缺失不影響GPX4野生型細(xì)胞的活力,但顯著加速了GPX4-KO細(xì)胞的死亡,如在無ferrostatin-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d后大部分DKO細(xì)胞死亡(圖5B-D)。值得注意的是,ferrostatin-1能完全抑制GPX4遺傳消融引起的HCT116細(xì)胞死亡,卻不能改變RSL3處理引起的死亡,說明RSL3具有脫靶效應(yīng),導(dǎo)致HCT116細(xì)胞非鐵死亡性細(xì)胞死亡(圖2M vs 圖5B-D)。一致地,DKO細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平明顯高于GPX4-KO細(xì)胞(圖5E)。在去除ferrostatin-1后,DKO細(xì)胞而非單KO細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的線粒體脂質(zhì)過氧化(圖5F)。

有幾種 GPX4 亞型具有不同的亞細(xì)胞定位,包括細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體 GPX4。 作者在GPX4-KO或DKO細(xì)胞中恢復(fù)細(xì)胞溶質(zhì)或線粒體GPX4,分級分析證實,細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體GPX4正確定位于各自的隔室(圖5G)。隨后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)細(xì)胞溶質(zhì)GOX4而非線粒體GPX4顯著抑制了GPX4-KO細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡(圖5H-I)。與此形成鮮明對比的是,細(xì)胞溶質(zhì)GPX4未能抑制DKO細(xì)胞的鐵死亡性細(xì)胞死亡(圖4J),而線粒體GPX4的過表達(dá)顯著推遲了DKO細(xì)胞的死亡,并且這種DKO細(xì)胞的死亡動力學(xué)與線粒體GPX4恢復(fù)似乎與GPX4-KO 細(xì)胞的恢復(fù)相似(圖5B vs圖5J)。ferrostatin-1后的第5天(在DKO細(xì)胞經(jīng)歷鐵死亡之前),線粒體GPX4的恢復(fù)顯著抑制了DKO細(xì)胞中總脂質(zhì)過氧化或線粒體脂質(zhì)過氧化的誘導(dǎo),但胞質(zhì)GPX4的恢復(fù)無抑制作用(圖5K-L)。總之,這些數(shù)據(jù)表明GPD2與線粒體GPX4平行作用,但不與胞質(zhì)GPX4作用,以抑制線粒體脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。


 

5 GPD2與線粒體GPX4協(xié)同作用抑制細(xì)胞鐵死亡

 

6、GPD2與線粒體GPX4協(xié)同抑制腫瘤鐵死亡

最后作者在體內(nèi)探究GPD2和/或GPX4失活是否通過誘導(dǎo)鐵死亡影響腫瘤生長。由于可獲得的GPD抑制劑(iGP-1)在本系統(tǒng)模型中無法發(fā)揮作用,并且沒有適用于動物模型的GPX4抑制劑,所以作者采用了基因?qū)W的方法解決該問題。注射對照、GPX4-KO、GPD2-KO、或DKO的HCT116細(xì)胞至裸鼠中,然后監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPX4-KO而非GPD2-KO顯著抑制腫瘤生長,然而DKO組表現(xiàn)出更顯著的腫瘤生長抑制,重要的是鐵死亡抑制劑liproxstatin-1處理幾乎完全恢復(fù)了DKO組腫瘤生長(圖6M-N)。進(jìn)一步的分析顯示,盡管cleaved caspase-3和Ki67染色在不同基因型或處理之間沒有顯著差異,但脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物4-HNE的表達(dá),與對照組和GPD2-KO腫瘤相比,在DKO組水平更高,使用liproxstatin-1治療后,4-HNE染色水平完全恢復(fù)到對照組的水平(圖6O)。在DKO背景下,線粒體GPX4的恢復(fù)部分回復(fù)了腫瘤生長,同時恢復(fù)胞質(zhì)和線粒體GPX4完全使腫瘤生長回復(fù)到與對照腫瘤相似的水平,而恢復(fù)細(xì)胞質(zhì)GPX4或GPD2對腫瘤生長沒有影響(圖6P-Q)。這些體內(nèi)結(jié)果支持了前面的體外研究,即GPD2與線粒體GPX4協(xié)同抑制腫瘤鐵死亡。


6 GPD2與線粒體GPX4協(xié)同抑制腫瘤鐵死亡

 

綜上所述,本研究證實GPD2通過在線粒體內(nèi)膜生成CoQH2來抑制線粒體脂質(zhì)過氧化,從而抵御細(xì)胞鐵死亡(圖6R)。

 

參考文獻(xiàn):

Wu Shiqi., Mao Chao., Kondiparthi Lavanya., Poyurovsky Masha V., Olszewski Kellen., Gan Boyi.(2022). A ferroptosis defense mechanism mediated by glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 in mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A, 119(26), e2121987119. doi:10.1073/pnas.2121987119