表征與唾液酸化相關(guān)的長(zhǎng)非編碼RNA，以開發(fā)一種新的信號(hào)來預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后、免疫狀況和化療反應(yīng)

結(jié)直腸癌（CRC）是2020年全球第三大最常見和第二致命的腫瘤。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的5年生存率僅為14%，這凸顯了早期和精確識(shí)別不同風(fēng)險(xiǎn)人群的患者以進(jìn)行適當(dāng)和個(gè)性化治療的必要性。正常的分期過程遵循美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）的標(biāo)準(zhǔn)，這是基于腫瘤大?。═），淋巴結(jié)受累（N）和轉(zhuǎn)移（M）的TNM分期系統(tǒng)。CRC的共識(shí)分子亞型（CMS）也被提出作為基于基因表達(dá)的亞型。盡管這兩種分期策略在CRC治療選擇中很有價(jià)值，但同一亞型的患者仍可能表現(xiàn)出廣泛的臨床結(jié)局差異；因此，需要更精細(xì)的分類方法來提供更個(gè)性化的治療策略。此外，癌細(xì)胞對(duì)化療和靶向藥物的耐藥性仍然很常見，并嚴(yán)重阻礙了癌癥的管理。預(yù)測(cè)每位患者藥物敏感性的工具有助于指導(dǎo)治療決策。最近，免疫學(xué)方法之一的程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）抗體治療已被證明僅在治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高腫瘤方面成功，這使得85%的CRC患者無法從免疫療法中受益。新版本的免疫檢查點(diǎn)抑制劑有望擴(kuò)大免疫療法的療效。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)來預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后、治療反應(yīng)和發(fā)展。該研究發(fā)表于《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》，IF: 8.786。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 識(shí)別預(yù)后唾液酸化相關(guān)的lncRNA特征

探索唾液酸化相關(guān)lncRNA在結(jié)直腸癌中的預(yù)后價(jià)值的過程顯示在圖1。首先，將543名臨床信息完整的患者隨機(jī)分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組。作者從MsigDB網(wǎng)站上下載了120個(gè)參與唾液酸和Siglec相互作用的mRNA，并帶有l(wèi)ncRNA注釋。正如皮爾遜相關(guān)性所揭示的那樣，共有1268個(gè)lncRNA與mRNA強(qiáng)相關(guān)，閾值為|r|訓(xùn)練組中>0.3和P<0.001。作者接下來專注于這些與唾液酸化相關(guān)的lncRNA;單因素Cox回歸分析顯示9個(gè)lncRNA與患者OS顯著相關(guān)（P<0.01，圖2A)。ZEB1反義RNA 1（ZEB1-AS1），LOC100506691，編號(hào)：AC092687.3和編號(hào)：AC010973.2風(fēng)險(xiǎn)比（HR）超過1，這表明它們是危險(xiǎn)因素。其余5個(gè)lncRNA，LOC100507403，LINC00261，ITGB8反義RNA 1（ITGB8-AS1），ENTPD1反義RNA 1（ENTPD1-AS1）和B4GALT1反義RNA 1（B4GALT1-AS1）是HR的保護(hù)因子<1。

圖1 本研究的流程圖

其次，通過多元Cox回歸和逐步算法構(gòu)建了基于7種唾液酸化相關(guān)lncRNA的簽名?；蛉缦拢篫EB1-AS1，編號(hào)：AC092687.3、LOC100506691、LOC100507403、ENTPD1-AS1、LINC00261和ITGB8-AS1。每個(gè)lncRNA的系數(shù)（圖2B）與單變量Cox回歸中的HR值具有相同的趨勢(shì)。具體來說，ZEB1-AS1，編號(hào)：AC092687.3，LOC100506691顯示正系數(shù)導(dǎo)致較高的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，而LOC100507403、ENTPD1-AS1、LINC00261和ITGB8-AS1具有負(fù)系數(shù)，因?yàn)樗鼈兪潜Ｗo(hù)因素。

5種lncRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平均顯著較高，但LINC00261（無差異）和LOC100507403（在正常組織中顯著升高）除外（圖2C)。在組合組中，7種唾液酸化相關(guān)的lncRNA在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間表達(dá)顯著差異，由中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖2D)。此外，通過Spearman檢驗(yàn)計(jì)算了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與七種唾液酸化相關(guān)lncRNA的關(guān)系；LINC00261呈最高負(fù)相關(guān)（r = ?0.567，圖2E)。

圖2 構(gòu)建與唾液酸化相關(guān)的lncRNA特征

2. 基于七種唾液酸化相關(guān)lncRNA驗(yàn)證特征，用于生存預(yù)測(cè)和作為獨(dú)立預(yù)后因素

根據(jù)每組計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)類型。訓(xùn)練、測(cè)試和組合集的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存狀態(tài)顯示在圖3A（上）。在高危組中觀察到較高的死亡率，表明訓(xùn)練組（圖3A（左），P<0.001）和測(cè)試集（圖3A（中），P= 0.036）。高?；颊叩腛S明顯更差（圖3A（右），P<0.001），DSS （圖3B，P< 0.001）和PFS（圖3C，P< 0.001）在TCGA組合集合中。

圖3 驗(yàn)證TCGA中唾液酸化相關(guān)lncRNA標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值

為了檢查臨床病理特征與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)系，χ2在組合集合上使用檢驗(yàn)和Cox回歸。高危組和低危組OS、靜脈浸潤(rùn)、臨床分期、轉(zhuǎn)移分期、淋巴結(jié)分期、CMS差異，χ2測(cè)試 （圖4A）。此外，基于7種唾液酸化相關(guān)lncRNA的簽名分層的風(fēng)險(xiǎn)組與M、N和T階段以及癌胚抗原水平顯著無關(guān)，OS的多元Cox回歸結(jié)果證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（HR = 4.343，95%CI = 2.223–8.482，P< 0.001，圖4B）， PFS（HR = 1.695，95% CI = 1.095–2.623，P= 0.018，圖4C）和DSS（HR = 3.243，95%CI = 1.525–6.896，P= 0.002，圖4D）。這些結(jié)果表明，作者的唾液酸化相關(guān)的結(jié)直腸癌lncRNA標(biāo)記對(duì)于預(yù)測(cè)生存結(jié)果是可靠的，可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素。

圖4 驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床病理特征之間的關(guān)系

3. 結(jié)合臨床特征的列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證

由于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分獨(dú)立于其他臨床特征，作者試圖優(yōu)化特征以提高臨床效率。基于OS的多變量Cox回歸分析，作者整合了年齡，M分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以生成預(yù)測(cè)1年，3年，5年和7年后生存概率的列線圖（圖5A)。評(píng)估列線圖預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的ROC曲線顯示，列線圖在1年（AUC = 0.769）、3年（AUC = 0.771）、5年（AUC = 0.781）和7年（AUC = 0.808）（圖5B)。此外，繪制校準(zhǔn)曲線以檢查實(shí)際測(cè)量結(jié)果和預(yù)測(cè)預(yù)后值的一致性。結(jié)果表明，列線圖的預(yù)測(cè)結(jié)果與觀測(cè)結(jié)果高度一致（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，作者成功地建立了一個(gè)列線圖，該列線圖結(jié)合了與唾液酸化相關(guān)的lncRNA特征和臨床特征，以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

圖5 列線圖的構(gòu)建和評(píng)估

4. 唾液酸化相關(guān)lncRNA標(biāo)記的潛在機(jī)制分析

為了探索風(fēng)險(xiǎn)特征對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行分層的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了突變、KEGG通路、GSEA和GO分析。由于體細(xì)胞突變是惡性腫瘤的主要原因，作者使用“maftool”包可視化了TCGA中突變譜的景觀，其中前20個(gè)最常見的突變分別顯示在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中（圖6A）。Fisher試驗(yàn)顯示，除突變基因TP53（圖6B）。此外，兩組體細(xì)胞突變和新抗原數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6C）。這些結(jié)果表明，基于唾液酸化lncRNA的標(biāo)記的預(yù)后意義可能與體細(xì)胞突變無關(guān)。

圖6 高危和低危組的體細(xì)胞突變

接下來，作者進(jìn)行了通路分析和GSEA，以研究與唾液酸化相關(guān)的lncRNA特征的潛在生物學(xué)重要性。共有603個(gè)DEG被識(shí)別為|log。2（FC）|> 0.5和調(diào)整后的P<0.05 使用R包“edgeR”（圖7A)。GSEA顯示，與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)的通路，如基底細(xì)胞癌、ECM-受體相互作用、局灶粘附和刺猬信號(hào)通路，在高危組中富集，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低的患者具有豐富的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、氧化磷酸化、過氧化物酶體和核糖體（圖7B)。此外，GSEA顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組（圖7C)。在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)較高的患者中，富含膠原蛋白和軸突的途徑，例如軸突發(fā)育，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分，膠原原纖維組織和軸索生成的調(diào)節(jié)。作者還對(duì)603個(gè)DEGs進(jìn)行了GO分析，并確認(rèn)免疫過程參與了CRC患者的唾液酸化特征相關(guān)劃分（圖 7D)。通路分析表明，免疫學(xué)和細(xì)胞外組成可能解釋了作者簽名的辨別力。

圖7 分析唾液酸化相關(guān)lncRNA特征的潛在生物學(xué)途徑

5. 唾液酸化相關(guān)特征評(píng)分的免疫微環(huán)境

為了進(jìn)一步研究免疫過程是否與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分密切相關(guān)，作者挖掘了TCGA轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，通過在TIMER中使用反卷積算法來探索兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間腫瘤免疫浸潤(rùn)的差異。MCP-counter（圖8A）和EPIC（圖8B）均表明，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（稱為腫瘤間充質(zhì)的關(guān)鍵成分）在高風(fēng)險(xiǎn)患者中顯著更高?？鼓[瘤免疫細(xì)胞，如EPIC（圖8B）和TIMER（圖8C），以及CD8+ T細(xì)胞和CIBERSORT鑒定的幼稚B細(xì)胞（圖8D）在低風(fēng)險(xiǎn)組中的比例較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，作者使用GSVA計(jì)算免疫浸潤(rùn)（圖8E)。有趣的是，與高風(fēng)險(xiǎn)組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞比例更高，無論它們是抗腫瘤、中細(xì)胞還是促腫瘤免疫細(xì)胞，如GSVA熱圖所示。

圖8 不同風(fēng)險(xiǎn)人群的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

此外，為了研究免疫系統(tǒng)亞基因，作者檢查了參與炎癥活動(dòng)和免疫分子的關(guān)鍵基因。檢查所選基因與唾液酸化相關(guān)lncRNA之間的相關(guān)性（圖9A）。Serpin家族B成員1（SERPINB1）和組織蛋白酶S（CTSS）與7個(gè)lncRNA中的4個(gè)顯著相關(guān)，即ITGB8-AS1，LINC00261，ZEB1-AS1和LOC100506691。特定基因和家族，包括淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（LCK）途徑；免疫球蛋白G（IgG）、MHC 家族和溶細(xì)胞活性基因，例如白細(xì)胞介素7受體（IL7R）、CD48、免疫球蛋白重常數(shù)γ1（IGHG1）、CTSE和CD209（圖9B）；和免疫刺激劑，如CD28、IL6R 和TNFSF13 (圖9C），在高風(fēng)險(xiǎn)樣品中的表達(dá)率顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，不同風(fēng)險(xiǎn)組的免疫原性各不相同。

圖9 免疫相關(guān)基因與唾液酸化相關(guān)lncRNA特征的相關(guān)性分析

6. 唾液酸化相關(guān)lncRNA特征的驗(yàn)證

作者使用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光來探索不同細(xì)胞表面的唾液酸化模式。作者觀察到HCoEpiC和HCT116細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于LoVo細(xì)胞（圖10A-C )當(dāng)細(xì)胞表面用SNA染色時(shí)，SNA是一種與α-2，6連接的唾液酸結(jié)合的特定凝集素。這些結(jié)果表明，LoVo細(xì)胞的唾液酸化水平顯著降低。為了確認(rèn)這七個(gè)唾液酸化相關(guān)的lncRNA標(biāo)記基因的表達(dá)，對(duì)HCoEpiC和結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116和LoVo）進(jìn)行了RT-qPCR。將HCT116細(xì)胞與HCoEpiC進(jìn)行比較，作者發(fā)現(xiàn)ENTPD1-AS1，ITGB81-AS1，LINC00261，LOC100506691，LOC100507403和ZEB1-AS1在腫瘤細(xì)胞中顯著過表達(dá)（圖10D）。將LoVo細(xì)胞與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行比較，作者發(fā)現(xiàn)LOC100506691和ZEB1-AS1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)較高，而ENTPD1-AS1，LINC00261和LOC100507403在正常細(xì)胞中的表達(dá)較高。編號(hào)： AC092687.3ITGB8-AS1在細(xì)胞類型之間沒有顯著差異。

作者還使用了兩個(gè)GEO隊(duì)列，GSE147602和GSE198103，以調(diào)查作者簽名的預(yù)后能力。在GSE147602，該公式計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與LOC100506691，ZEB1-AS1，ITGB8-AS1，ENTPD1-AS1和LINC00261具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖10E）。如圖10F，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與轉(zhuǎn)移分期顯著相關(guān)，但與其他臨床病理特征（如性別和年齡）無顯著相關(guān)性。在GSE198103，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與編號(hào)：AC092687.3、LINC00261和ITGB8-AS1（圖10G）。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移期患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著高于局部或區(qū)域分期患者（圖10H）。唾液酸化相關(guān)的lncRNA標(biāo)記評(píng)估CRC患者預(yù)后的能力被這兩個(gè)隊(duì)列清楚地驗(yàn)證。

圖10 驗(yàn)證與唾液酸化相關(guān)的lncRNA特征

7. 高危和低危組結(jié)直腸癌患者的藥物敏感性預(yù)測(cè)

為了評(píng)估作者的唾液酸化相關(guān)特征在臨床治療中的應(yīng)用，并確定針對(duì)高?；颊叩挠星巴镜乃幬铮髡叻治隽嘶熕幬锏拿舾行?。在預(yù)測(cè)了543名患者的1900種化合物的敏感性后，作者在兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間進(jìn)行了Wilcoxon測(cè)試，并將調(diào)整后的P<0.05（圖11A)。在GDSC的198種化合物中，低風(fēng)險(xiǎn)組中有49種化合物的IC50顯著降低，而高風(fēng)險(xiǎn)組中只有5種化合物。臨床化療常用藥物見圖11B。5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑的IC50在風(fēng)險(xiǎn)組間無差異，而喜樹堿、伊立替康和多西他賽的IC50在低風(fēng)險(xiǎn)組中顯著降低，這意味著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低的患者可能對(duì)這些化療化合物更敏感。靶向受體酪氨酸激酶（RTK）途徑的化合物，如西地尼、沃利替尼、福替尼和索拉非尼，預(yù)計(jì)在低風(fēng)險(xiǎn)組中更有效。兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組在靶向細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）途徑的化合物方面沒有差異。

CTRP中的44種化合物和PRISM中的280種化合物在高風(fēng)險(xiǎn)組中的AUC顯著降低。氯硝柳胺和苯丁酸氮芥處于兩個(gè)數(shù)據(jù)庫（圖11C），這意味著在CTRP（圖11D）和PRISM（圖11E）的高危組中，它們都被預(yù)測(cè)為較低的AUC。作者的研究結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)特征可以支持臨床藥物選擇，氯硝柳胺和苯丁酸氮芥可能適用于高風(fēng)險(xiǎn)患者。

圖11 探索風(fēng)險(xiǎn)特征和藥物敏感性

結(jié)論：

綜上所述，該研究是迄今為止對(duì)唾液酸化相關(guān)lncRNA在結(jié)直腸癌患者中臨床意義的最系統(tǒng)的探索。作者成功開發(fā)并驗(yàn)證了一種新型的七唾液酸化相關(guān)lncRNA標(biāo)記，該標(biāo)記在預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后，免疫狀態(tài)和化療敏感性方面表現(xiàn)出準(zhǔn)確的性能。該研究可為結(jié)直腸癌患者的臨床預(yù)后預(yù)測(cè)提供創(chuàng)新視角，為深化免疫治療改善和個(gè)體化抗腫瘤治療的理論基礎(chǔ)做出貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

Zhou M, Lv S, Hou Y, Zhang R, Wang W, Yan Z, Li T, Gan W, Zeng Z, Zhang F, Yang M. Characterization of sialylation-related long noncoding RNAs to develop a novel signature for predicting prognosis, immune landscape, and chemotherapy response in colorectal cancer. Front Immunol. 2022 Oct 18;13:994874. doi: 10.3389/fimmu.2022.994874.