外泌體CircATG4B編碼的新蛋白通過(guò)促進(jìn)自噬誘導(dǎo)結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-02-22
本文鑒定circRNA circATG4B在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中起重要作用,并發(fā)現(xiàn)circATG4B通過(guò)促進(jìn)自噬誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥......


奧沙利鉑是結(jié)直腸癌(CRC)手術(shù)后常用的化療方案。然而,獲得性耐藥嚴(yán)重影響CRC患者的療效,其機(jī)制尚不清楚。本文鑒定circRNA circATG4B在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中起重要作用。并發(fā)現(xiàn)circATG4B通過(guò)促進(jìn)自噬誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。此外,circATG4B的作用歸因于其編碼一種新型蛋白質(zhì)circATG4B-222aa的潛力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circATG4B-222aa作為誘餌,和TMED10競(jìng)爭(zhēng)與ATG4B的相互作用,導(dǎo)致自噬增加,隨后誘導(dǎo)耐藥。因此,本研究揭示外泌體circATG4B參與CRC細(xì)胞化療敏感性的降低,為CRC奧沙利鉑耐藥的潛在治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。本研究于2022年12月9日發(fā)表于《AdvSci (Weinh)》,IF17.521

 

技術(shù)路線


 

主要研究結(jié)果

1、ATG4B相關(guān)circRNA在奧沙利鉑耐藥中的分析

越來(lái)越多的證據(jù)證明circRNA參與宿主基因的功能?;谠诰€數(shù)據(jù)庫(kù)circBase,作者評(píng)估15種源于ATG4B的circRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0 007159 (circATG4B)在奧沙利鉑耐藥患者CRC組織中顯著上調(diào)(圖1A),與細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)一致(圖1B)。以cDNA和基因組DNA(gDNA)為模板,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證,結(jié)果表明,擴(kuò)增的cDNA中只有預(yù)期大小的產(chǎn)物,而gDNA中沒(méi)有(圖1C)。此外,Sanger測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的circATG4B頭尾剪接,提示circATG4B來(lái)源于ATG4B基因的外顯子,這與circBase中circATG4B數(shù)據(jù)是一致的(圖1D)。與線性形式相比,circATG4B具有較長(zhǎng)的半衰期,并對(duì)RnaseR處理具有抗性(圖1E-F),進(jìn)一步說(shuō)明circATG4B確實(shí)以環(huán)狀形式存在。FISH結(jié)果顯示circATG4B主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,在耐奧沙利鉑CRC細(xì)胞中比敏感細(xì)胞中含量高的多(圖1G)。接著,作者評(píng)估幾種奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系和匹配的CRC細(xì)胞中的circATG4B水平。與這些結(jié)果一致的是,circATG4B在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞系顯著高表達(dá)(圖1H)。Kaplan - Meier生存分析顯示,在circATG4B低表達(dá)的患者中,接受奧沙利鉑治療的患者無(wú)病生存期(DFS)顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(圖1I)。相反,在circATG4B水平較高的患者中,奧沙利鉑治療組與對(duì)照組的DFS時(shí)間無(wú)差異(圖1J)。此外,作者發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑治療僅在circATG4B低表達(dá)的患者中是獨(dú)立的預(yù)后因素,而在circATG4B高表達(dá)的患者中則不是(表1)。此外,在接受奧沙利鉑治療的隊(duì)列中,與circATG4B低表達(dá)的患者相比,circATG4B高表達(dá)的患者有更差的DFS(圖1K)。這些結(jié)果表明circATG4B與CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的反應(yīng)密切相關(guān)。


圖1 circATG4B在奧沙利鉑相關(guān)CRC細(xì)胞過(guò)表達(dá)


表1

 

2、外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

作者猜想circATG4B可能從奧沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到奧沙利鉑敏感細(xì)胞。為證明這個(gè)猜想,作者從耐奧沙利鉑CRC細(xì)胞上清中分離出外泌體,經(jīng)電鏡鑒定為典型的具有雙層膜的圓形顆粒(圖2A)。NTA(納米顆粒追蹤分析)發(fā)現(xiàn)顆粒大?。▓D2B)。圖2C展示外泌體外泌體因子CD45,CD9和Annexin的表達(dá)。qRT-PCR顯示,circATG4B在奧沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞系中明顯上調(diào),尤其是在HCT116-L-OHP和SW480-L-OHP細(xì)胞系衍生的外泌體中上調(diào)(圖2D),與細(xì)胞表達(dá)水平一致。當(dāng)CRC細(xì)胞與來(lái)自?shī)W沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞的外泌體(PKH26標(biāo)記)共培養(yǎng)時(shí),在受體細(xì)胞中觀察到大量外泌體(紅色),表明CRC細(xì)胞具有較高的外泌體攝取效率(圖2E)。在與分離的外泌體或PBS在母本細(xì)胞中孵育后,作者發(fā)現(xiàn)circATG4B由于與用si-NC或不使用si-NC處理的奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)而顯著上調(diào),當(dāng)外泌體的circATG4B被siRNA擊殺后,這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)(圖2F)。

假定外泌體circATG4B來(lái)源于奧沙利鉑耐藥細(xì)胞,作者進(jìn)一步研究其對(duì)化療耐藥的影響。作者的結(jié)果展示與exo-si-NC相比,共孵育exo-si-circATG4B增加CRC細(xì)胞中奧沙利鉑對(duì)小鼠細(xì)胞凋亡的抑制率和誘導(dǎo)率(圖2G-H)。為探索體內(nèi)外泌體circATG4B的作用,采用皮下注射HCT116細(xì)胞建立小鼠異種移植模型。每4天測(cè)量一次腫瘤的大小,16天后處死所有的小鼠(圖2I)。exo-si- NC處理的腫瘤的生長(zhǎng)率和腫瘤重量均高于外源性exo-si-circATG4B或PBS處理的腫瘤(圖2J-L)。這表明CRC中外泌體circATG4B對(duì)奧沙利鉑的敏感性降低。以上結(jié)果說(shuō)明外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥


圖2外泌體轉(zhuǎn)移的circATG4B誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

 

3、外泌體CircATG4B提高奧沙利鉑抗藥過(guò)程的活性

自噬在化療耐藥中起著重要的作用,因此作者測(cè)量抗奧沙利鉑細(xì)胞和親代細(xì)胞的自噬水平。值得注意的是,在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞中觀察到LC3B-II/I的比例高于相應(yīng)的親本細(xì)胞(圖3)。為確定自噬是否對(duì)奧沙利鉑耐藥至關(guān)重要,作者用雷帕霉素(RAPA,自噬誘導(dǎo)物)處理CRC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RAPA治療誘發(fā)藥物耐藥(圖3B)。相反,作者發(fā)現(xiàn)3-MA(甲基腺嘌呤),一種常見的自噬抑制劑,增加耐藥CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性(圖3C),進(jìn)一步表明自噬在奧沙利鉑耐藥中起重要作用。此外,作者發(fā)現(xiàn)用外對(duì)照處理的CRC細(xì)胞比用PBS處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的耐藥性,并且這種化學(xué)耐藥性在用PBS處理后大大逆轉(zhuǎn)(圖3D),表明外泌體可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬,促進(jìn)從藥物敏感到耐藥的轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)染circATG4B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的CRC細(xì)胞化療耐藥性增加。然而,3-MA處理逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)(圖3E ),表明circATG4B可以通過(guò)自噬誘導(dǎo)化療耐藥。此外,作者探究外泌體circATG4B在自噬過(guò)程中的作用。用奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞分泌的多種外泌體處理后,在受體細(xì)胞系HCT116和SW480中進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。免疫熒光(IF)染色結(jié)果顯示,exo-si-NC預(yù)處理的CRC細(xì)胞中自噬小體形成顯著增加,而circATG4B水平降低的外泌體預(yù)處理的CRC細(xì)胞中綠色斑點(diǎn)數(shù)量減少(圖3F)。此外,TEM分析顯示,exo-si-NC預(yù)處理后自噬體數(shù)量增加,而exo-sio-circATG4B預(yù)處理后自噬體數(shù)量明顯減少(圖3G)。此外,與PBS處理相比,轉(zhuǎn)染si - NC的奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的外泌體處理顯著促進(jìn)LC3B - I到II的轉(zhuǎn)化,而當(dāng)外泌體circATG4B被敲低時(shí),LC3B - II積累被抑制(圖3H)。此外,在前期建立的異種移植小鼠模型中IHC結(jié)果顯示,與exo-si-NC組相比,exo-si-circATG4B處理的CRC細(xì)胞中p62的表達(dá)水平顯著升高,LC3B和Ki67(細(xì)胞增殖的標(biāo)志物)的表達(dá)水平降低(圖3I),進(jìn)一步證實(shí)外泌體circATG4B通過(guò)調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。


圖3外泌體circATG4B促進(jìn)自噬水平

 

4CircATG4B編碼一種新的222氨基酸(aa)蛋白,CircATG4B-222a

RIP結(jié)果顯示circATG4B與AGO2不相關(guān)(圖4A),提示circATG4B可能通過(guò)不同的機(jī)制行使其功能。查閱circ RNA Db中的注釋,作者發(fā)現(xiàn)circATG4B有一個(gè)669 nt的開放閱讀框(ORF),具有編碼222個(gè)氨基酸蛋白的潛力(圖4B)。在circATG4B的ORF中,circRNA序列中串聯(lián)的' AUG '密碼子可以啟動(dòng)新蛋白的翻譯,而終止密碼子' UAG '可以終止翻譯。包含有33個(gè)特異性氨基酸的新序列命名為' circATG4B-222aa '(圖4C)。

由于circRNA沒(méi)有5′- cap序列,可以啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯,因此需要一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。作者在ORF中發(fā)現(xiàn)一個(gè)IRES,并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circATG4B中IRES的活性(圖4D-E)。為確認(rèn)circATG4B - 222aa的存在,研究構(gòu)建4個(gè)帶有不同flag標(biāo)簽的載體,并將其克隆到CMV誘導(dǎo)表達(dá)載體中(圖4F)。在轉(zhuǎn)染circATG4B - flag載體或circATG4B - flag - mut載體的CRC細(xì)胞中,circATG4B的表達(dá)明顯上調(diào)。與轉(zhuǎn)染空載體相比,轉(zhuǎn)染circATG4B - 222aa載體并未明顯改變circATG4B的表達(dá)(圖4G)。這4種載體均不影響線性ATG4B mRNA水平。此外,ATG4B的表達(dá)不受4種載體的影響(圖4H)。最后,通過(guò)SDS - PAGE分離轉(zhuǎn)染circATG4B和空載體的HEK - 293T細(xì)胞總蛋白,切取大小約為24 kD的蛋白條帶進(jìn)行LC - MS / MS分析,成功鑒定出circATG4B剪接連接處形成的獨(dú)特肽段序列,表明circATG4B能夠編碼一種新的蛋白(圖4I)。此外,circATG4B - 222aa在化療耐藥的CRC細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高(圖4J)。將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞后,使用抗鞭毛抗體進(jìn)行免疫熒光染色以鑒定circATG4B-222aa的細(xì)胞質(zhì)定位(圖4K)。最后,circATG4B - 222aa表達(dá)與接受奧沙利鉑治療的CRC患者的不良預(yù)后呈正相關(guān),表明circATG4B - 222aa可能是奧沙利鉑耐藥的預(yù)后標(biāo)志物(圖4L)。


圖4 circATG4B編碼能力的評(píng)價(jià)

 

5、CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內(nèi)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

為探究circATG4B - 222aa的生物學(xué)功能,將上述4種帶不同flag標(biāo)簽的載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染circATG4B或circATG4B - 222aa過(guò)表達(dá)載體后,LC3B的點(diǎn)狀聚集數(shù)量、自噬體形成和LC3B - I / II的轉(zhuǎn)換均顯著增加(圖5A-C)。而轉(zhuǎn)染circATG4B - mut載體的CRC細(xì)胞無(wú)明顯變化,推測(cè)其無(wú)法啟動(dòng)circATG4B - 222aa的翻譯。這些結(jié)果表明,僅過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa可增加自噬水平。有趣的是,過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa降低奧沙利鉑敏感性和奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而過(guò)表達(dá)突變體circATG4B對(duì)這些現(xiàn)象無(wú)明顯影響(圖5D-E)。為進(jìn)一步探討circATG4B - 222aa在體內(nèi)的作用,通過(guò)皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同circATG4B載體的HCT116細(xì)胞建立異種移植小鼠模型。每4 d測(cè)量一次腫瘤的大小,circATG4B和circATG4B - 222aa組的生長(zhǎng)速度和腫瘤重量均大于vector對(duì)照組和circATG4B - mut組(圖5F-H)。檢測(cè)裸鼠移植瘤中LC3B、p62和Ki67的表達(dá)。IHC結(jié)果顯示,與對(duì)照組和circATG4B - mut組相比,circATG4B和circATG4B - 222aa組中LC3B和Ki67的表達(dá)水平顯著升高,p62的表達(dá)水平顯著降低(圖5I)??傊?,這些結(jié)果表明circATG4B-222aa而不是circATG4B增加CRC細(xì)胞的自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。


圖5 CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加體內(nèi)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥

 

6CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED10介導(dǎo)的抑制

為探索circATG4B - 222aa在自噬中的潛在作用機(jī)制,將帶有鞭毛的circATG4B - 222aa質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK - 293T細(xì)胞中,免疫共沉淀和質(zhì)譜分析檢測(cè)circATG4B - 222aa潛在的相互作用蛋白。作者對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定(圖6A),發(fā)現(xiàn)在識(shí)別蛋白的排序列表中豐度最高的蛋白為TMED10(圖6B)。因此,推測(cè)TMED10是circATG4B - 222aa的潛在靶點(diǎn)。此外,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)circATG4B - 222aa在CRC細(xì)胞中確實(shí)與TMED10存在相互作用(圖6C)。在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶有flag標(biāo)簽的circATG4B - 222aa,免疫熒光染色也表明circATG4B - 222aa與TMED10存在共定位(圖6D)。

為探究TMED10與circATG4B - 222aa相互作用的結(jié)構(gòu)域,作者構(gòu)建一系列帶有GFP標(biāo)簽的TMED10缺失突變體(圖6E)。TMED10的LD - only突變體與circATG4B - 222aa不結(jié)合,表明TMED10的TD和CD都是TMED10與circATG4B - 222aa相互作用所必需的(圖6F)。通過(guò)對(duì)circATG4B - 222aa的帶有flag標(biāo)簽的截短突變體進(jìn)行Co - IP分析,作者也鑒定circATG4B - 222aa參與TMED10 - circATG4B - 222aa相互作用的區(qū)域(圖6G)。circATG4B-222aa ( aa1 - 111)和circATG4B - 222aa ( aa112 ~ 222)的截短體均可被TMED10拉下(圖6H),表明全長(zhǎng)circATG4B - 222aa與TMED10存在相互作用。

在進(jìn)一步的研究中,作者發(fā)現(xiàn)circATG4B - 222aa的表達(dá)增加LC3B - I / II的轉(zhuǎn)換,但兩個(gè)截短突變體均不能(圖6I),表明全長(zhǎng)circATG4B - 222aa負(fù)責(zé)自噬過(guò)程。Co - IP結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa削弱TMED10與ATG4B的相互作用(圖6J),表明circATG4B - 222aa導(dǎo)致ATG4B與TMED10解離。作者進(jìn)一步在CRC細(xì)胞中驗(yàn)證TMED10與circATG4B - 222aa的相互作用。在CRC細(xì)胞中,增加circATG4B - 222aa水平通過(guò)激活A(yù)TG4B增強(qiáng)GLUC連接的LC3的切割(圖6K)。這些結(jié)果表明circATG4B - 222aa可能作為TMED10的誘餌,逃避TMED10誘導(dǎo)的ATG4B抑制。

圖6 CircATG4B-222aa防止ATG4B的影響TMED 10介導(dǎo)的抑制

 

7、在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中,CircATG4B – 222aa逆轉(zhuǎn)TMED10誘導(dǎo)的化療敏感性

隨后,作者評(píng)估circATG4B - 222aa與TMED10的相互作用在奧沙利鉑耐藥中的功能。circATG4B - 222aa逆轉(zhuǎn)TMED10誘導(dǎo)的CRC耐藥細(xì)胞凋亡和化療敏感性的增加(圖7A-B)。為進(jìn)一步研究circATG4B - 222aa與TMED10在體內(nèi)的功能聯(lián)系,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞移植瘤小鼠于第16天給予奧沙利鉑治療。過(guò)表達(dá)TMED10細(xì)胞組的腫瘤生長(zhǎng)和重量均顯著下降,而過(guò)表達(dá)circATG4B - 222aa逆轉(zhuǎn)這種抑癌作用(圖7C-E)。這些結(jié)果表明circATG4B - 222aa可以通過(guò)與TMED10相互作用并增加自噬活性來(lái)誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥(圖7F)。


圖7在奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞中,Circatg4B - 222Aa逆轉(zhuǎn)Tmed10誘導(dǎo)的化療敏感性

 

結(jié)論:

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑耐藥的CRC細(xì)胞來(lái)源的上調(diào)的外泌體circATG4B可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中,從而在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥。此外,circATG4B編碼一個(gè)新的功能蛋白(circATG4B-222aa)。circATG4B-222aa在體內(nèi)外均可促進(jìn)CRC細(xì)胞自噬并誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥,但circATG4B本身并不促進(jìn)自噬。此外,circATG4B - 222aa與TMED10存在競(jìng)爭(zhēng)性相互作用,并作為誘餌阻止TMED10與ATG4B結(jié)合,導(dǎo)致自噬增加并誘導(dǎo)耐藥。總之,本研究證明circRNA在CRC耐藥獲得中的新機(jī)制。新型circATG4B - 222aa是重要的生物標(biāo)志物,可能作為奧沙利鉑耐藥CRC的潛在治療靶點(diǎn)。

 

參考文獻(xiàn)

Pan Z, Zheng J, Zhang J, Lin J, Lai J, Lyu Z, et al. (2022) A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy. AdvSci (Weinh);9(35):e2204513. doi: 10.1002/advs.202204513.