C/D box小核仁RNA SNORD104通過調(diào)節(jié)PARP1的2'O-甲基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌（EC）是發(fā)達(dá)國家絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。盡管手術(shù)、化療和放療取得了令人滿意的結(jié)局，但由于腫瘤細(xì)胞有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的趨勢，EC患者的生存率仍然很低。因此，闡明EC起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機制對于確定個性化治療的潛在治療靶點至關(guān)重要。小核仁RNA（snoRNA）是一類具有保守結(jié)構(gòu)元件的小非編碼RNA（ncRNA），廣泛分布在真核細(xì)胞的核仁中，大致分為C/D box snoRNA（SNORD）和H/ACA box snoRNA。它們通常由編碼基因或非編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域編碼，并且由于宿主基因的轉(zhuǎn)錄和加工而變得復(fù)雜，只有少數(shù)由獨立的基因組位置編碼。最近的研究表明，snoRNA通過互補堿基配對介導(dǎo)rRNA、tRNA、mRNA、snRNA和其他RNA的2'-O-甲基化和假尿苷化，并通過與核糖核仁蛋白（RNP）形成snoRNP復(fù)合物來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。該研究發(fā)表于《Journal of Translational Medicine》，IF：8.44。

研究路線：

主要研究結(jié)果：

1. SNORD104在EC組織中上調(diào)

作者分析了來自TCGA數(shù)據(jù)集的548個EC組織樣本和35個正常子宮內(nèi)膜組織樣本的轉(zhuǎn)錄組譜（圖1A），并發(fā)現(xiàn) SNORD104 在 EC 樣品中上調(diào)。為了驗證這些結(jié)果，作者分析了廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院收集的術(shù)后EC組織中SNORD104的表達(dá)，并分析了SNORD104表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。與I/II期疾病患者（n = 46）相比，III/IV期疾病患者（n = 13）的SNORD104表達(dá)更高（圖1B）。此外，SNORD104在低分化（n = 15）與中分化或高分化（n = 44）腫瘤中上調(diào)（圖1C）。與淺肌層浸潤患者（n = 33）相比，深部肌層浸潤（n = 26）患者的SNORD104表達(dá)更高（圖1D），以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（n = 26）相對于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（n = 33）的SNORD104表達(dá)也更高（圖1E）。相比之下，SNORD104表達(dá)與血管浸潤之間沒有顯著相關(guān)性（圖1F）。因此，作者假設(shè)SNORD104在EC中作為癌基因起作用。

圖1SNORD104在EC組織中上調(diào)，并與臨床病理特征相關(guān)

2. 敲低SNORD104在體外抑制EC細(xì)胞的惡性電位

基因組序列分析表明，SNORD104是從SNHG25基因（小核仁RNA宿主基因25，位于17q21.3）的初級轉(zhuǎn)錄本的第一內(nèi)含子區(qū)域加工而來的（圖1G），成熟的SNHG25 RNA是從外顯子轉(zhuǎn)錄而來的。作者發(fā)現(xiàn)SNHG25在EC組織中也上調(diào)。此外，與永生化子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比，SNORD104在EC細(xì)胞系中上調(diào)。SNORD104和SNHG25在石川細(xì)胞中均高表達(dá)，但在HEC1B和HEC1A細(xì)胞中表達(dá)水平相對較低（圖2A）。先前的研究表明，snoRNA的宿主基因調(diào)節(jié)其各自的snoRNA并在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。為了確定SNORD104和SNHG25在EC細(xì)胞中的作用，作者分別用SNHG25特異性小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染石川細(xì)胞，用SNHG25過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEC1B細(xì)胞，并在HEC1B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染靶向SNORD104的反義寡核苷酸序列（ASO）。通過qRT-PCR驗證了敲低效率（圖2B）。SNORD104敲低顯著降低了石川細(xì)胞的生存能力、增殖（圖2C，D）、克隆容量（圖2E）、遷移和入侵（圖2G），并增加了細(xì)胞凋亡率（圖2F）。相比之下，敲低或過表達(dá)SNHG25對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和凋亡幾乎沒有影響。

圖2 SNORD104敲低在體外抑制EC生長

3. SNORD104促進(jìn)體外和體內(nèi)EC進(jìn)展

用SNORD104質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEC1B細(xì)胞（圖3A）表現(xiàn)出高增殖能力（圖3B-D），以及入侵和遷移速率的增加（圖3E）。此外，SNORD104過表達(dá)降低了HEC1B細(xì)胞的凋亡率（圖3F）。與體外結(jié)果一致，與接種空載體的對照細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)SNORD104的HEC1B細(xì)胞在裸鼠中形成明顯更大的腫瘤（圖3G）。綜上所述，SNORD104的過表達(dá)顯著增強了體外EC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長。

圖3 SNORD104過表達(dá)促進(jìn)體外和體內(nèi)EC生長

4. SNORD0104通過促進(jìn)2'O-甲基化上調(diào)和穩(wěn)定PARP1

SNORDs和H/ACA box snoRNA分別通過2'O-甲基化和假尿苷化調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此，作者假設(shè)SNORD104可能參與FBL介導(dǎo)的2'O-甲基化。事實上，使用抗FBL抗體對來自SNORD104過表達(dá)HEC1B細(xì)胞的裂解物的RIP測定顯示，免疫沉淀物中SNORD104顯著富集（圖4A）。然而，SNORD104過表達(dá)不影響FBL蛋白水平（圖4B)。

為了鑒定由SNORD104介導(dǎo)的2'O-甲基化調(diào)控的潛在靶基因，作者在對照和SNORD104過表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行了NM-seq。如圖4C所示，2?-O-甲基化在928個甲基化位點（671個RNA）上調(diào)（倍數(shù)變化≥2）。據(jù)報道，小核仁RNA通常通過互補堿基配對來指導(dǎo)靶RNA的修飾。因此，作者將具有上調(diào)的 2'O-甲基化水平的 RNA 和具有 SNORD104 互補堿基配對片段的 RNA 相交。接下來，作者對這些高甲基化RNA進(jìn)行了KEGG途徑富集分析。結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡相關(guān)通路排名第一。此外，作者分析了細(xì)胞凋亡途徑中的富集RNA，CPTAC數(shù)據(jù)庫顯示其編碼蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中上調(diào)，包括ITPR3，LMNB1，PARP1，PARP4和TUBA1C。接下來，作者使用RIP測定來檢測FBL蛋白是否與這5個RNA結(jié)合，并使用蛋白質(zhì)印跡來檢測由這5個RNA編碼的蛋白質(zhì)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，只有PARP1 mRNA與FBL蛋白結(jié)合（圖4D），只有PARP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平發(fā)生變化（圖4E，F）。因此，作者接下來分析了術(shù)后EC組織中PARP1的表達(dá)，并觀察到SNORD104和PARP1表達(dá)水平之間存在正相關(guān)（圖4G）。PARP1主要位于細(xì)胞核中，參與DNA損傷修復(fù)和核糖體生物發(fā)生。與此一致，SNORD104過表達(dá)增加了核級分中的PARP1蛋白水平。此外，SNORD104過表達(dá)異種移植物也顯示出PARP1蛋白水平增加（圖4I，J）。

圖4 SNORD104在體外和體內(nèi)上調(diào)PARP1表達(dá)

接下來進(jìn)行RTL-P測定以檢測PARP1 mRNA中的2'-O-甲基化水平（圖5A）。敲低和過表達(dá)SNORD104分別降低和增加PARP1 mRNA的2'-O-甲基化水平（圖5B，C）。此外，SNORD104過表達(dá)HEC1B細(xì)胞中的FBL敲低降低了2'-O甲基化的PARP1 mRNA和PARP1蛋白水平（圖5D，F）。核糖2'-O-甲基化在mRNA中的生物學(xué)作用尚不清楚，盡管有報道稱它可以提高核酸對堿性或酶水解的穩(wěn)定性，最有可能通過改變其物理和化學(xué)性質(zhì)。為了驗證這一假設(shè)，作者用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理SNORD104過表達(dá)或敲低細(xì)胞。與對照組相比，SNORD104過表達(dá)細(xì)胞具有顯著更高的PARP1 mRNA穩(wěn)定性（圖5G），而敲低SNORD104或FBL降低了PARP1 mRNA的穩(wěn)定性（圖5H，I）。

圖5 SNORD104通過2'O-甲基化穩(wěn)定PARP1 mRNA

5. SNORD104通過調(diào)節(jié)PARP1促進(jìn)EC生長

PARP1在各種癌癥中作為癌基因起作用。對TCGA和CPTAC數(shù)據(jù)集的搜索顯示，EC組織中的PARP1 RNA和蛋白質(zhì)水平顯著增加（圖6A）。此外，Kaplan-Meier分析顯示PARP1的高表達(dá)與不良的總生存期相關(guān)（圖6B）。驗證SNORD104是否通過調(diào)節(jié)過表達(dá)SNORD104的HEC1B細(xì)胞中的PARP1、敲低FBL或PARP1發(fā)揮其致癌作用（圖6C）。正如預(yù)期的那樣，FBL或PARP1沉默逆轉(zhuǎn)了SNORD104對增殖（圖6D，E）、菌落形成（圖6F）和EC細(xì)胞的凋亡（圖6G）的影響。

圖6 敲低FBL或PARP1逆轉(zhuǎn)了SNORD104的致癌作用

結(jié)論：

SNORD104在EC中上調(diào)，并通過誘導(dǎo)PARP1的2'O-甲基化來促進(jìn)腫瘤生長，從而增強后者的表達(dá)和生物學(xué)功能。該研究結(jié)果為EC發(fā)生和進(jìn)展的機制提供了新的見解，并為個體化治療確定了新的治療靶點。

參考文獻(xiàn)：

Lu B, Chen X, Liu X, Chen J, Qin H, Chen S, Zhao Y. C/D box small nucleolar RNA SNORD104 promotes endometrial cancer by regulating the 2'-O-methylation of PARP1. J Transl Med. 2022 Dec 24;20(1):618. doi: 10.1186/s12967-022-03802-z.