CircMBOAT2通過穩(wěn)定PTBP1促進(jìn)FASN mRNA細(xì)胞質(zhì)輸出促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌進(jìn)展和脂質(zhì)代謝重編程

FASN通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程的致癌作用已在多種腫瘤中得到證實(shí)。然而，肝內(nèi)膽管癌（ICC）進(jìn)展過程中的機(jī)制，如circRNAs，是否調(diào)節(jié)FASN的表達(dá)尚不清楚。在這里，作者證明一個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNA，circMBOAT2在ICC組織中頻繁上調(diào)，并且與ICC的惡性特征呈正相關(guān)。機(jī)制上，circMBOAT2與PTBP1結(jié)合，保護(hù)PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解，損害PTBP1將FASN mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)的功能。研究結(jié)果證實(shí)，circMBOAT2在ICC中表達(dá)上調(diào)，并通過穩(wěn)定PTBP1促進(jìn)FASN mRNA胞質(zhì)輸出促進(jìn)ICC進(jìn)展，從而改變ICC的脂質(zhì)代謝輪廓和調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)，提示circMBOAT2可能作為脂質(zhì)代謝活躍的ICC的治療靶點(diǎn)。本研究于2023年1月發(fā)表于《Cell Death Dis》，IF：9.685。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、  CircMBOAT2在ICC中上調(diào)，且與脂質(zhì)代謝相關(guān)

代謝重編程是癌癥的標(biāo)志，ICC也不例外。作者利用RNA - seq分析7個(gè)配對(duì)ICC樣本中circRNA的表達(dá)譜。在ICC組織中共鑒定出420個(gè)滿足以下條件的失調(diào)circRNA：（1） |平均標(biāo)準(zhǔn)化倍數(shù)變化|≥1；（2） P值< 0.05，其中82個(gè)上調(diào)，338個(gè)下調(diào)。接下來，通過GO和KEGG通路分析對(duì)所選circRNAs的基因功能進(jìn)行闡釋。在KEGG通路分類分析中，'有機(jī)系統(tǒng)'（154個(gè)基因）和'代謝'（169個(gè)基因）類別占優(yōu)勢(shì)。在"代謝"類別中，"脂質(zhì)代謝"包括31個(gè)基因（圖1A）。此外，KEGG富集分析表明篩選的circRNA主要與代謝相關(guān)，包括"亞油酸代謝"和"花生四烯酸代謝"（圖1B）。這些結(jié)果表明ICC中顯著差異的circRNAs與脂質(zhì)代謝相關(guān)。在與脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNAs中，circMBOAT2在ICC腫瘤與癌旁正常組織中差異最為明顯。作者隨后證實(shí)ICC與正常膽管組織/細(xì)胞之間的差異表達(dá)（圖1C-D）。Kaplan - Meier分析顯示circMBOAT2高表達(dá)與（P = 0.055）患者較短的OS相關(guān)（圖1E）。circMBOAT2由MBOAT2的第2至第3外顯子產(chǎn)生，長度為224nt。使用發(fā)散型和收斂型引物擴(kuò)增繩頭插接結(jié)合位點(diǎn)和circMBOAT2全長，并通過Sanger測序驗(yàn)證（圖1F）。通過circBase數(shù)據(jù)庫注釋PCR分析發(fā)現(xiàn)，circMBOAT2可以用gDNA中的發(fā)散引物、隨機(jī)六聚體反轉(zhuǎn)錄的c DNA和oligo（dT）引物擴(kuò)增。然而，circMBOAT2只能在隨機(jī)六聚體反轉(zhuǎn)錄的cDNA中用收斂引物擴(kuò)增，而不能用gDNA或oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA（圖1G）?？?/span>RNase R核酸外切酶消化實(shí)驗(yàn)證明circMBOAT2具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1H）。通過核質(zhì)分離和FISH發(fā)現(xiàn)circMBOAT2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)（圖1I-J）。這些結(jié)果表明circMBOAT2是一個(gè)在ICC中廣泛分布的circRNA。

圖1 CircMBOAT2在ICC中上調(diào)，且與脂質(zhì)代謝相關(guān)

2、circMBOAT2促進(jìn)體內(nèi)外ICC進(jìn)程

為研究circMBOAT2在ICC進(jìn)展中的功能作用，作者檢測7種細(xì)胞系中circMBOAT2的內(nèi)源性表達(dá)。結(jié)果顯示，circMBOAT2在QBC - 939、HCCC - 9810、RBE、CCLP1和FRH細(xì)胞中的表達(dá)高于正常膽管上皮細(xì)胞H69細(xì)胞（圖1D）。由于RBE和HCCC - 9810細(xì)胞是公認(rèn)的，并且是ATCC細(xì)胞庫中唯一保留的兩種細(xì)胞系，因此在接下來的實(shí)驗(yàn)中使用它們。

采用CCK-8、克隆形成、EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測敲低和過表達(dá)細(xì)胞系的生物學(xué)功能。這些結(jié)果表明，在RBE和HCCC - 9810細(xì)胞中，敲低circMBOAT2抑制細(xì)胞增殖和克隆形成，但促進(jìn)細(xì)胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滯（圖2A-E）。為進(jìn)一步研究敲低circMBOAT2抑制細(xì)胞增殖、凋亡和GO/G1期阻滯的機(jī)制，作者通過WB檢測關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)水平。circMBOAT2敲低顯著降低c - myc、Bcl - 2和cyclin D1蛋白水平，增加Bax蛋白水平（圖2F）。

為評(píng)估circMBOAT2在體內(nèi)的生物學(xué)功能，將不同克隆的RBE細(xì)胞接種于裸鼠皮下構(gòu)建異種移植瘤模型。結(jié)果證實(shí)，干擾circMBOAT2的表達(dá)后，腫瘤生長明顯受到抑制（圖2G）。相反，與對(duì)照組相比，circMBOAT2高表達(dá)組的平均腫瘤體積和重量更大，腫瘤生長更快（圖2I）。由于sh-circMBOAT2組腫瘤組織體積較小，作者取其他3組材料進(jìn)行IHC染色，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，上調(diào)circMBOAT2組增殖細(xì)胞（Ki67 +和PCNA +）比例增加（圖2H-J）。此外，作者在32例ICC患者組織中發(fā)現(xiàn)circMBOAT2與Ki - 67的表達(dá)具有顯著相關(guān)性（圖2K）。總之，這些發(fā)現(xiàn)暗示circMBOAT2促進(jìn)ICC生長。

圖2 circMBOAT2促進(jìn)體內(nèi)外ICC進(jìn)程

3、CircMBOAT2調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程，尤其是不飽和脂質(zhì)

由于circMBOAT2表達(dá)與脂質(zhì)代謝相關(guān)，從RNA-seq的分析結(jié)果來看，作者使用BODIPY493/503探針檢測ICC細(xì)胞中中性脂滴含量。結(jié)果表明中性脂滴含量與circMBOAT2 的表達(dá)呈正相關(guān)（圖3A-B）。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)（圖3C-D）。然后，作者對(duì)circMBOAT2敲低的細(xì)胞進(jìn)行RNA - seq和非靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)circMBOAT2調(diào)節(jié)ICC中的脂質(zhì)代謝重編程。GSEA顯示，在circ MBOAT2 KD的HCCC - 9810細(xì)胞中，不飽和脂肪酸途徑相關(guān)基因的生物合成受到影響（圖3E）。在GSEA分析中，作者還發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因也與circMBOAT2相關(guān)，進(jìn)一步證明circMBOAT2促進(jìn)ICC生長（圖3E）。非靶向脂質(zhì)組學(xué)鑒定出474種脂質(zhì)，分屬于14類（圖3F）。主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，circMBOAT2 KD的HCCC - 9810細(xì)胞與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)差異較大（圖3G）。circMBOAT2敲低的HCCC - 9810細(xì)胞中的脂質(zhì)種類發(fā)生變化（圖3H），不飽和脂質(zhì)與飽和脂質(zhì)相比發(fā)生明顯的變化。因此，作者的數(shù)據(jù)表明circMBOAT2促進(jìn)ICC脂質(zhì)代謝重編程，尤其是不飽和脂質(zhì)代謝重編程，這可能是ICC進(jìn)展的一個(gè)特征。

圖3 CircMBOAT2調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重編程

4、CircMBOAT2在ICC細(xì)胞中與PTBP1相互作用

為探索circMBOAT2是否通過與蛋白質(zhì)相互作用來實(shí)現(xiàn)其功能，作者進(jìn)行RNA pull - down實(shí)驗(yàn)來探索與之相關(guān)的蛋白質(zhì)。RNA pull - down實(shí)驗(yàn)中沉淀的蛋白用10 % SDS - PAGE分離，銀染檢測（圖4A）。利用LC-MS / MS對(duì)circMBOAT2探針下拉的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4B。在這些蛋白中，FASN被發(fā)現(xiàn)是一種脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，可與正義和反義探針結(jié)合。另一種RNA結(jié)合蛋白PTBP1，已被報(bào)道在多種癌癥中調(diào)節(jié)糖代謝重編程，并與正義探針特異性相互作用。值得注意的是，在沉淀中沒有發(fā)現(xiàn)AGO2，進(jìn)一步證實(shí)circMBOAT2不通過ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用。作者進(jìn)行WB分析，與LC - MS / MS結(jié)果一致，PTBP1和FASN均與circMBOAT2結(jié)合（圖4C）。通過RIP實(shí)驗(yàn)，作者證實(shí)PTBP1特異性結(jié)合circMBOAT2而不是FASN（圖4D-E）。此外，作者在HCCC - 9810細(xì)胞系中進(jìn)行RNA FISH免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)circMBOAT2與PTBP1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都存在共定位（圖4F）。與circMBOAT2的亞細(xì)胞定位一致，PTBP1也主要分布在細(xì)胞核中（圖4G）。這些結(jié)果表明circ MBOAT2通過與PTBP1結(jié)合發(fā)揮作用。

圖4CircMBOAT2在ICC細(xì)胞中與PTBP1相互作用

5、CircMBOAT2保護(hù)PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解

采用WB檢測RBE和HCCC - 9810細(xì)胞中circMBOAT2與PTBP1的關(guān)系。結(jié)果顯示，敲低circMBOAT2降低PTBP1蛋白水平，相反，過表達(dá)circMBOAT2增加PTBP1蛋白水平（圖5A-B）。通過IHC，作者發(fā)現(xiàn)circMBOAT2和PTBP1在32例ICC患者組織中的表達(dá)具有顯著相關(guān)性（圖5C）。值得注意的是，在過表達(dá)circMBOAT2的情況下，FASN蛋白水平升高，表明FASN可能以間接的方式被調(diào)控（圖5B）。然后作者在ICC細(xì)胞中進(jìn)行PCR和WB分析，進(jìn)一步檢測circMBOAT2和PTBP1之間的關(guān)系。為證實(shí)circMBOAT2不影響PTBP1的RNA穩(wěn)定性，作者進(jìn)行RNA聚合酶II抑制劑放線菌素（ActD）追趕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，敲低circMBOAT2的細(xì)胞中PTBP1的mRNA水平無明顯變化（圖5D）。相反，用CHX處理后，作者發(fā)現(xiàn)敲低circMBOAT2增加PTBP1蛋白的半衰期（圖5E）。因此，作者推測circMBOAT2可能通過相互作用穩(wěn)定PTBP1蛋白。作者研究敲低circMBOAT2是否顯著降低PTBP1蛋白水平，而這種作用可以被蛋白酶體抑制劑MG132恢復(fù)（圖5F）。此外，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低circMBOAT2顯著增加PTBP1 （圖5G-H）的泛素化水平。這些結(jié)果表明circMBOAT2通過保護(hù)PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解來增加PTBP1的穩(wěn)定性。

圖5CircMBOAT2保護(hù)PTBP1免受泛素/蛋白酶體依賴的降解

6、CircMBOAT2促進(jìn)PTBP1介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)輸出FASN mRNA

作者通過RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTBP1可以與FASN mRNA結(jié)合（圖6A）。為研究PTBP1與FASN mRNA結(jié)合后的功能，作者使用兩組siRNAs（siPTBP1 # 1和si - PTBP1 # 2）檢測PTBP1敲低后FASN mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)PTBP1敲低后沒有顯著差異（圖6B）。說明PTBP1不影響FASN mRNA的穩(wěn)定性。與在ICC細(xì)胞系中的表現(xiàn)一致，與癌旁非腫瘤組織相比，FASN的RNA水平在ICC組織和癌旁正常組織中無明顯差異（圖6C）。然而，FASN蛋白的表達(dá)水平與circMBOAT2顯著相關(guān)（圖6D）。在RBE和HCCC - 9810細(xì)胞中敲低PTBP1后，FASN的蛋白水平降低（圖6E）。為研究PTBP1是否介導(dǎo)FASN mRNA的選擇性剪接，作者從NCBI中查找FASN的剪接形式，設(shè)計(jì)含有該剪接區(qū)的引物。通過Sanger測序，作者發(fā)現(xiàn)敲低PTBP1后FASN的剪接形式?jīng)]有改變（圖6G）。因此，作者推測PTBP1可以促進(jìn)FASN mRNA的胞質(zhì)輸出。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行核質(zhì)分離和FISH實(shí)驗(yàn)。有趣的是，作者觀察到PTBP1敲低后，RBE和HCCC - 9810細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)FASN mRNA水平明顯降低（圖6F-I）。作者進(jìn)一步研究PTBP1敲低對(duì)FASN表達(dá)的影響。PTBP1敲低消除circMBOAT2過表達(dá)對(duì)RBE中FASN表達(dá)的影響（圖6J）。這些結(jié)果表明，在ICC細(xì)胞中circMBOAT2通過與PTBP1相互作用促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)輸出和FASN mRNA的表達(dá)。

圖6CircMBOAT2促進(jìn)PTBP1介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)輸出FASN mRNA

7、花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）干預(yù)circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的ICC進(jìn)展

作者接著研究circMBOAT2在ICC進(jìn)展中的作用是否依賴于FASN通路。檢測si - FASN # 1、si - FASN # 2、si - FASN # 3三組siRNA的效率，均能降低FASN的表達(dá)（圖7A）。效率較高的si - FASN # 2和si - FASN # 3用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK - 8、Ed U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)的體外實(shí)驗(yàn)表明，在RBE和HCCC - 9810細(xì)胞中，FASN表達(dá)降低抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)早期和晚期凋亡以及GO/G1期阻滯（圖7B - E）。

接下來，作者通過脂質(zhì)組學(xué)比較對(duì)照、circMBOAT2沉默或FASN沉默的ICC細(xì)胞之間的脂質(zhì)水平。PCA分析表明，ICC細(xì)胞中FASN的下調(diào)與circMBOAT2沉默平行（圖7F）。這些數(shù)據(jù)表明circMBOAT2促進(jìn)ICC進(jìn)展的脂質(zhì)代謝重編程功能依賴于FASN通路。因此，ICC細(xì)胞中不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸的水平發(fā)生顯著變化。

基于偏最小二乘判別分析（PLS-DA），作者發(fā)現(xiàn)兩種n - 6 PUFAs，花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）的比例在circMBOAT2沉默組和FASN沉默組中顯著降低（圖7G），因此作者探究這兩種n - 6 PUFAs在FASN介導(dǎo)的ICC進(jìn)展中的功能。在體外，CCK - 8、EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)表明，FASN表達(dá)降低在功能上抑制HCCC - 9810細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滯，這種作用可以被額外的花生四烯酸和腎上腺酸補(bǔ)充所逆轉(zhuǎn)（圖8A - C）。這初步表明花生四烯酸和腎上腺酸在ICC中FASN致癌性中的可能作用。

圖7花生四烯酸（C20：4）和腎上腺酸（C22：4）干預(yù)circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的ICC進(jìn)展

8、CircMBOAT2通過FASN降低ICC細(xì)胞氧化應(yīng)激

為進(jìn)一步研究circMBOAT2參與的信號(hào)通路，作者對(duì)上述組織和細(xì)胞進(jìn)行RNA - seq轉(zhuǎn)錄組測序。KEGG通路富集分析顯示circRNAs與細(xì)胞色素P450通路相關(guān)（圖1B）。與之一致，circMBOAT2 - KD觸發(fā)鐵死亡和NF - κ B信號(hào)通路（圖8D）。這些結(jié)果表明circMBOAT2參與調(diào)節(jié)ICC的氧化還原穩(wěn)態(tài)。至此，作者檢測HCCC - 9810細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平和活性氧（ROS）水平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達(dá)circMBOAT2抑制FASN - KD誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和ROS產(chǎn)生（圖8E , F），這解釋之前敲低FASN和circMBOAT2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。超氧化物歧化酶（SOD1和SOD2）、谷胱甘肽過氧化物酶1 （GPX1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、核因子E2相關(guān)因子2 （NRF2）和血紅素加氧酶1 （HO-1）的mRNA水平在FASN - KD細(xì)胞中顯著升高，當(dāng)circMBOAT2過表達(dá)時(shí)恢復(fù)（圖8G）。此外，過表達(dá)circMBOAT2抑制FASN - KD促進(jìn)的NRF2在ICC細(xì)胞中的表達(dá)（圖8H）。這些結(jié)果表明circMBOAT2促進(jìn)ICC的脂質(zhì)代謝重編程，該過程受circMBOAT2 / PTBP1 / FASN軸的調(diào)控。

圖8 CircMBOAT2通過FASN降低ICC細(xì)胞氧化應(yīng)激

圖9circMBOAT2促進(jìn)ICC進(jìn)展的工作模型。

結(jié)論

作者的研究首次提出ICC脂質(zhì)代謝重編程受circMBOAT2調(diào)控，并與其進(jìn)展相關(guān)。機(jī)制上，作者發(fā)現(xiàn)circMBOAT2結(jié)合并穩(wěn)定PTBP1，從而有助于FASN mRNA的胞質(zhì)輸出。FASN的上調(diào)改變ICC的脂質(zhì)代謝輪廓并調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)。重要的是，作者的研究結(jié)果表明，沉默circMBOAT2為ICC治療提供新的治療策略。

參考文獻(xiàn)

Yu X, Tong H, Chen J, Tang C, Wang S, Si Y, Wang S, Tang Z. CircRNA MBOAT2 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression and lipid metabolism reprogramming by stabilizing PTBP1 to facilitate FASN mRNA cytoplasmic export. Cell Death Dis. 2023 Jan 12;14（1）:20. doi: 10.1038/s41419-022-05540-y. PMID: 36635270; PMCID: PMC9837196.