RNA去甲基化酶ALKBH5通過(guò)ITPA m6A修飾促進(jìn)t(8;21)急性髓系白血病的發(fā)生

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-04-21
染色體平衡易位t(8;21)是急性髓系白血病(AML)最常見(jiàn)的遺傳畸變之一。即使t(8;21)患者被認(rèn)為是低危AML,但仍有......


染色體平衡易位t8;21)是急性髓系白血?。?/span>AML)最常見(jiàn)的遺傳畸變之一。即使t8;21)患者被認(rèn)為是低危AML,但仍有40~50%的患者接受單獨(dú)化療后不可避免地復(fù)發(fā)。KIT基因突變似乎是t8;21)患者最常見(jiàn)的附加基因事件,預(yù)后較差。同種異體造血干細(xì)胞移植似乎是KIT突變患者的治療方法,然而即使在接受治療后,2年累積復(fù)發(fā)率也可接近32%2年無(wú)白血病生存率僅為55%,這表明迫切需要開(kāi)發(fā)更有效的治療方法來(lái)改善患者的預(yù)后。該研究發(fā)表于《Biomarker Research》,IF8.633。


技術(shù)路線(xiàn):



主要研究結(jié)果:

1. ALKBH5T8;21AML患者中過(guò)表達(dá),是 Kasunmi-1細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的

與正常MNC相比,ALKBH5mRNA水平上在t8;21AML患者中高表達(dá)(圖1A)。作者的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)顯示,ALKBH5t8;21AML患者中的表達(dá)明顯更高(圖1B)。同樣,與MNCs相比,Kasumi-5細(xì)胞中的ALKBH1蛋白水平更高(圖1C)。此外,基于TCGA-LAML隊(duì)列的ALKBH5升高與AML患者的總生存期縮短有關(guān)(圖1D)。

為了研究ALKBH5t8;21AML中的作用,在Kasumi-5細(xì)胞中構(gòu)建了敲低ALKBH1細(xì)胞模型(圖1E-F)。敲低ALKBH5能實(shí)質(zhì)性抑制增殖(圖1G-H)和顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖1IL)。敲低ALKBH5也顯著抑制了人原發(fā)性AML細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖1J),并促進(jìn)人大塊AML細(xì)胞的凋亡(圖1KM)。作者進(jìn)一步檢測(cè)了全局m6A水平并觀(guān)察到ALKBH5敲低誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞和原代細(xì)胞中的水平顯著增加(圖1N)。


1 ALKBH5t8;21AML細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的


2. 敲低ALKBH5損害(8;21AML維持

首先,RUNX1-RUNX1T1和套件N822Kmut共表達(dá)小鼠用作T8;21)白血病小鼠模型。為了確定(5;8AML維持是否需要ALKBH21,作者將ALKBH5 shRNA或?qū)φ?/span>shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到從 t8;21)只白血病小鼠收集的t8;21)白血病BM細(xì)胞中,并建立了BMT模型(圖2A)。敲低ALKBH5顯著抑制了體外菌落形成/重鋪試驗(yàn)檢測(cè)到的菌落數(shù)(圖2B)。敲低ALKBH5顯著損害了RUNX1-RUNX1T1KIT的進(jìn)展。N822Kmut-在受體小鼠中誘導(dǎo)t8;21AML(圖2C)。作者觀(guān)察到敲低ALKBH5顯著抑制了轉(zhuǎn)化供體細(xì)胞在外周血和BM中的植入(圖2D-E),并減少脾臟和肝臟中白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖2F-G)。接下來(lái),作者使用異種移植模型(CDXPDX)進(jìn)一步評(píng)估ALKBH5在維持人類(lèi)AML細(xì)胞中的潛在作用。正如預(yù)期的那樣,敲低ALKBH5顯著延長(zhǎng)了異種移植受體小鼠的存活期,并抑制了BM中白血病細(xì)胞的植入(圖2H-K)。


2 敲低ALKBH5影響小鼠和人類(lèi)AML的維持


3. 識(shí)別t5;8AMLALKBH21的潛在靶標(biāo)

為了探索 t5;8AMLALKBH21功能的潛在機(jī)制,作者對(duì)Kasumi-5細(xì)胞中的 ALKBH1 敲低進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在2326個(gè)shALKBH35個(gè)shNC樣品中鑒定出3個(gè)差異表達(dá)基因(DEG),包括1533個(gè)下調(diào)基因和793個(gè)上調(diào)基因(圖3A)。通過(guò)GOKEGG通路富集分析,作者確定了包含凋亡信號(hào)通路的前10個(gè)GO術(shù)語(yǔ)和前5個(gè)KEGG術(shù)語(yǔ)(圖3B-C),這與作者的發(fā)現(xiàn)一致,即敲低ALKBH5增加了Kasumi-1細(xì)胞的凋亡。然后,作者使用全局信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析確定了關(guān)鍵的DEG(圖3D)。

敲低ALKBH5顯著降低了人AML細(xì)胞系、原代AML細(xì)胞和鼠RR/KIT AML細(xì)胞在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄處的ITPA水平(圖4A)和蛋白質(zhì)水平(圖4B)。為了研究ITPA作為ALKBH5靶標(biāo)的功能重要性,作者在操縱ALKBH5ITPA表達(dá)時(shí)進(jìn)行了細(xì)胞增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖4C),發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH5對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用在很大程度上可以通過(guò)ITPA的強(qiáng)制表達(dá)來(lái)挽救(圖4D-E)。


3 Kasumi-1細(xì)胞中ALKBH5的潛在靶點(diǎn)鑒定


4 ITPAALKBH5功能重要的靶點(diǎn)


4. ALKBH5通過(guò)改變m6A修飾調(diào)控ITPA mRNA的穩(wěn)定性

由于ITPAALKBH5的陽(yáng)性靶標(biāo),也是增殖能力改變的驅(qū)動(dòng)因素,作者接下來(lái)研究了ALKBH5對(duì)ITPA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。敲低ALKBH5可能會(huì)影響mRNA輸出和RNA代謝,因此作者評(píng)估了ITPA mRNA的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位。敲低ALKBH5顯著降低了Kasumi-1細(xì)胞中ITPA mRNA的半衰期(圖5A),而似乎不影響ITPA RNA的核保留或輸出(圖5B)。此外,敲低ALKBH5不影響使用熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定測(cè)定的ITPA啟動(dòng)子活性(圖5C)。

為了確定ITPA mRNA是否是ALKBH5的底物,作者使用RNA免疫沉淀(RIP)結(jié)合qPCR測(cè)定。結(jié)果表明,與抗IgG抗體相比,抗ALKBH5抗體可以顯著富集ITPA轉(zhuǎn)錄本(圖5D)。此外,作者使用甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)結(jié)合qPCR來(lái)確定ITPA m6A ALKBH5敲低后的甲基化水平。與對(duì)照組相比,敲低ALKBH5增加了ITPA mRNA的水平(圖5E)。野生型ALKBH5的過(guò)表達(dá),但未報(bào)道的催化無(wú)活性突變體ALKBH5 H204A的過(guò)表達(dá)能夠恢復(fù)ITPA表達(dá)(圖5F),表明ALKBH5主要通過(guò)其去甲基化活性影響ITPA表達(dá)??傮w而言,作者的RIP-qPCR和基因特異性m6A-qPCR證實(shí)ITPAALKBH5的強(qiáng)結(jié)合,并且與ALKBH6敲低后AML細(xì)胞的m5A豐度顯著增加和預(yù)期表達(dá)水平變化相關(guān)。


5 ALKBH5通過(guò)影響ITPA mRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控其表達(dá)


5. TCF15通過(guò)提高其啟動(dòng)子活性來(lái)調(diào)節(jié)ALKBH5表達(dá)

為了研究為什么ALKBH5AML中高表達(dá),作者專(zhuān)注于富含ALKBH5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。作者從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了ALKBH5啟動(dòng)子區(qū),然后通過(guò)UCSC跟蹤JASPAR分析鑒定了600個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(圖6A)。根據(jù)TCGA-LAML數(shù)據(jù)集,作者通過(guò)Pearson分析發(fā)現(xiàn)TCF15NRF1ALKBH5顯著相關(guān)。作為一種已知的轉(zhuǎn)錄因子,TCF15對(duì)于多能性退出、造血干細(xì)胞(HSC)靜止和HSC長(zhǎng)期自我更新至關(guān)重要。然而,TCF15AML中的作用尚不清楚。在AML患者中,耐藥和復(fù)發(fā)與LSC/LIC的存在有關(guān)。由于Tcf15表達(dá)對(duì)HSC具有特異性,并且是HSC長(zhǎng)期自我更新所必需的,作者推測(cè)TCF15LSC/LIC自我更新所必需的。TCF15CD34 LSC / LICs中表達(dá),而不是CD34+?散裝AML細(xì)胞(圖6B)。此外,與CD5相比,ALKBH34CD34 LSC / LICs中高表達(dá)+?散裝AML細(xì)胞(圖6C)。為了確定TCF15是否直接調(diào)控ALKBH5,作者進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。潛在結(jié)合位點(diǎn)的缺失突變消除了TCF5過(guò)表達(dá)對(duì)ALHBH15啟動(dòng)子的反式活化(圖6D-E)。TCF15敲低顯著降低了LSCALKBH5ITPA在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)(圖6F-G)。

基于TCGA-LAML隊(duì)列,TCF15表達(dá)較高的AML患者與較短的OS相關(guān)(圖6H)。6ALKBH5敲低顯著抑制了人類(lèi)LSC/LICs的集落形成能力(圖6I)。此外,TCF15敲低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用在很大程度上可以通過(guò)ALKBH5的強(qiáng)制表達(dá)來(lái)挽救(圖6J)??傮w而言,TCF15/ALKBH5/ITPA軸在t8;21AML的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用(圖6K)。


6 TCF15通過(guò)提高ALKBH5的啟動(dòng)子活性來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)


結(jié)論:

該研究發(fā)現(xiàn)TCF15 / ALKBH5 / ITPA軸在AML發(fā)病機(jī)制和LSC / LIC維持中起著至關(guān)重要的作用。AML t8;21)預(yù)后良好,大多數(shù)患者進(jìn)入緩解期,然而,大約一半患者復(fù)發(fā),只有60%患者在診斷后存活超過(guò)5年。未來(lái),通過(guò)靶向TCF15 / ALKBH5 / ITPA來(lái)消除LSC / LICs代表了治療t8;21AML患者的有前途的治療策略。


參考文獻(xiàn):

Li R, Wu X, Xue K, Feng D, Li J, Li J. RNA demethylase ALKBH5 promotes tumorigenesis of t (8;21) acute myeloid leukemia via ITPA m6A modification. Biomark Res. 2023 Mar 10;11(1):30. doi: 10.1186/s40364-023-00464-x.