MYC和MET協(xié)同驅動具有不同分子特征和脆弱性的肝細胞癌
轉錄因子MYC和受體酪氨酸激酶MET的激活增強是肝細胞癌(HCC)中經常發(fā)生的事件之一。這兩個基因各自都是肝癌發(fā)生和發(fā)展的驅動因素。然而它們在HCC中的伴隨改變還未被探索。我們分析了五個獨立的人類HCC隊列的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了一個以預后不良為特征的高水平MYC和MET (MYChigh/METhigh)患者的子集。這一臨床觀察促使我們探索MYC和MET在體內共存的功能，結合水動力尾靜脈注射在R26stopMet遺傳背景下的MYC表達，其中野生型MET水平在基因缺失后增強。結果表明，即使在沒有與慢性疾病狀態(tài)相關的預先存在的損傷的情況下，肝細胞中MYC和MET表達的增加也足以誘導肝臟腫瘤的發(fā)生。MET腫瘤中的異位MYC增加了Mki67增殖標記物的表達，并將其轉化為Afp、Spp1、Gpc3、Epcam的缺失，同時Hgma1、Vim和Hep-Par1水平的升高。我們還發(fā)現(xiàn)了特異性免疫檢查點表達的開關，Ctla-4和Lag3淋巴細胞共抑制反應增加，腫瘤細胞的Icosl共刺激反應增加。我們提供了一些人HCC細胞系對聯(lián)合MYC和MET靶向的脆弱性的體外證據(jù)，這些細胞系對單一抑制具有抗性。機制上，MYC和MET的聯(lián)合阻塞將由MYC或MET單獨阻塞引發(fā)的部分細胞抑制作用轉化為細胞毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)突出了以MYChigh/METhigh為特征的HCC亞群，并記錄了MYC和MET在肝臟腫瘤發(fā)生中的功能協(xié)同作用。MYC-R26Met模型是HCC生物學、患者分類和治療的相關設置。本文于2022年11月發(fā)表于Cell Death and Disease(IF=9.685)。
技術路線：
結果：
在發(fā)育過程中MYC的過表達可以驅動HCC的形成，但通過水動力尾靜脈注射在C57BL6中表達MYC只會與其他致癌驅動因素聯(lián)合導致腫瘤。我們探討了MYC和MET的高表達水平是否在五種不同的人類HCC隊列中同時發(fā)生。LIRI-JP隊列中，236例MYChigh/METhighHCC患者中有40例(16.9%)(圖1A)。在另外兩個獨立的HCC患者隊列中，81例患者中有13例和32個中的11個為MYChigh/METhigh(圖1A)。在TCGA隊列中發(fā)現(xiàn)了較小比例的MYChigh/METhighHCC患者(2.7%;圖1A)。在所有HCC分析患者中，約18.8%為MYChigh/METhigh。
我們分析了MYChigh/METhighHCC患者亞群的臨床特征。與MYClow/METhigh相比，患者的總生存期更短(圖1B)。與MYClow/METhighHCC患者相比，MYChigh/METhighHCC患者沒有分子特征、病因或突變。
圖1：MYC和MET的高表達水平在一部分HCC患者中同時發(fā)生
(2) 在小鼠肝細胞亞群中MYC和MET的同時上調引發(fā)腫瘤發(fā)生
我們評估了高MYC和MET水平在HCC患者中同時存在是否在功能上與肝癌的發(fā)生有關。我們推斷R26stopMet基因設置中的強制MYC表達可能是建模該患者亞組的合適系統(tǒng)。我們進行了流體動力尾靜脈注射兩個質粒(a)短暫表達Cre重組酶，通過刪除一個停止盒(Cre質粒)允許METtg表達；(b)睡美人轉座酶的瞬時表達觸發(fā)Myc轉基因基因的基因組插入(Myc質粒;圖2A)。兩組對照組(單獨使用Cre或Myc質粒)隨訪24周后，均未出現(xiàn)任何肉眼可見的腫瘤發(fā)生跡象(圖2B, C)。相反，11/12只MYC-R26Met小鼠(通過尾靜脈注射同時使用Cre和MYC質粒產生)發(fā)生腫瘤(圖2B-D)。腫瘤重量在0.39-1.21 g之間，另外一個大腫瘤達到3.13 g(圖2E)。逆轉錄-定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)分析證實MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤相比MYC表達上調(圖2F)。在MYCR26Met和ALB-R26Met腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了相似的METtg表達水平(圖2F)。這些結果表明MYC和MET共同觸發(fā)小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生。
圖2：在小鼠肝細胞亞群中MYC和MET的同時上調引發(fā)腫瘤發(fā)生
(3) 在MET癌模型中MYC上調改變HCC的分子特性
病理學家復查蘇木精/伊紅染色，證實腫瘤具有中分化至高分化HCC的特征，由實體或小梁狀排列的多邊形腫瘤細胞組成(圖3A)。Ki67免疫熒光染色顯示MYC-R26Met腫瘤的增殖指數(shù)明顯高于Alb-R26Met腫瘤(圖3B, C)。通過RT-qPCR分析Mki67mRNA水平證實，MYC-R26Met腫瘤的增殖率明顯高于Alb-R26Met腫瘤(圖3D)。
為了進一步表征MYC-R26Met腫瘤，我們通過RT-qPCR分析了一系列標記物的mRNA水平。Afp(未分化HCC的標記物)、Spp1、Gpc3(早期HCC的標記物)和Epcam(干性標記物；圖3E, H)，表明MYC-R26Met腫瘤可能比Alb-R26Met腫瘤分化更大，處于更晚期。MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中與HCC特征相關的其他標志物(Saa1, Fabp1)、祖細胞(Hnf4a, Krt19)、Wnt通路(Glul, Lgr5, Oat)、代謝(Ark1b10, Gpx2)和分化標志物(Arg1, Ctlc, Hsp1, Yap1)的mRNA表達無任何差異(圖3H)。
我們研究了HMGA1的作用，HMGA1是一種非組蛋白染色質相關蛋白，最近被描述為MYC陰性三陰性乳腺癌中過表達的標記物。HMGA1是一種有效的致癌基因，可引發(fā)腫瘤進展，并與未分化的莖樣表型和侵襲性有關。HMGA1是依賴MYC促進莖干性和上皮-間充質轉化的正反饋循環(huán)的一部分。與Alb-R26Met腫瘤相比，Hgma1在MYC-R26Met腫瘤中上調(圖3F, H)，這與最近報道的Hgma1參與MYC調控一致。
為了進一步描述表型轉化，我們分析了描述良好的上皮-間充質轉化(EMT)標記的mRNA水平，并與MYC促進實體腫瘤中EMT的能力相關。與Alb-R26Met腫瘤相比，MYC-R26Met中Vimentin(Vim)間充質標記物增加，E-cadherin (Cdh1)上皮標記物減少(圖3G, H)，表明MYC-R26Met具有更多的間充質表型，這與侵襲性、預后差和對目前臨床使用的藥物的耐藥性有關。我們進行了免疫熒光分析，以進一步記錄MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中發(fā)現(xiàn)的分子開關。MET在Alb-R26Met和MYC-R26Met腫瘤中均有表達，而MYC高水平僅限于MYC-R26Met腫瘤(圖4A, B)。MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤相比，AFP和OPN減少，HMGA1和Hep-Par1染色增加(圖4A, B)。
最近的研究將MYC描述為不同實體癌中免疫微環(huán)境的重塑者。我們通過RT-qPCR探索MYC-R26Met腫瘤與Alb-R26Met腫瘤的免疫檢查點是否存在切換。相比于Alb-R26Met腫瘤，MYC-R26Met中Ctla4和Lag3表達更高(圖5A, B)。在MYC-R26Met和Alb-R26Met腫瘤中，Icosl mRNA水平有輕微增加，但其受體Icos無增加，這表明假定存在共刺激反應(圖5C)。
我們研究了MET腫瘤中MYC過表達后基因表達的轉換是否發(fā)生在其他小鼠模型中，在這些模型中，HCC是由流體動力學共注射質粒驅動MYC表達與不同已知癌基因(GSE148379)引發(fā)的。MYC與MET以外的癌基因的過表達并沒有導致MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中切換基因的表達發(fā)生顯著變化(Afp, Spp1, Gpc3, Epcam, Mki67, Hgma1, Csp1 (Hep-Par1)，Vim，Cdh1標記物，Ctla4, Lag3, Icosl免疫檢查點；圖5D)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了當MYC過表達在MET上調的情況下發(fā)生時，特定標記物水平的有趣切換。
圖3：Myc-R26Met和Alb-R26Met腫瘤的肝細胞特征
圖4：Myc-R26Met和Alb-R26Met腫瘤的分子特征
圖5：MYC上調改變MET癌模型中HCC的免疫相關分子特性
(4) MYC和MET的組合靶向在人類HCC細胞亞群中給予反應性
根據(jù)轉錄組學數(shù)據(jù)，一組人肝癌細胞系先前已被細分為三個亞群。CL1亞群對應于大多數(shù)分化的細胞。CL3對應于分化較低的細胞，具有間充質特征，以及侵襲性和干細胞樣標記物。CL2亞群對應于具有混合上皮-間充質、肝特異性和干細胞樣特征的細胞。MYC和MET水平之間沒有發(fā)現(xiàn)相關性，只有CL3亞組有不顯著的趨勢。我們選擇了CL1和CL3人類HCC細胞的一個子集來分析細胞提取物中的MYC和MET蛋白水平。細胞在MYC和MET水平上表達程度略有不同(圖6A, B)，無明顯相關性。JHH5細胞的特征是MET磷酸化和下游GAB1信號的激活，與HGF的表達一致以及自分泌MET激活(圖6A)。
我們選擇了三種人HCC細胞系(JHH5、Hep3B和Huh7)，涵蓋了一系列MYC和MET水平，以評估細胞對其靶向反應的活力。使用10058-F4抑制MYC，其干擾MYC-MAX相互作用并阻止MYC靶基因表達的轉激活。10058-F4以劑量依賴的方式降低了測試的HCC細胞的活力(圖6C)。cabozantinib是臨床用于HCC治療的一種多RTK抑制劑，它對MET的抑制僅部分干擾了我們測試的人類HCC細胞的活力(圖6C)。阻斷MYC和MET這兩種藥物的聯(lián)合使用顯著降低了我們測試的人類HCC細胞的活力(圖6C)。我們使用了另一種MYC靶向劑Omomyc，一種在癌細胞中作為阻斷MYC功能的顯性陰性劑的肽。處理72 h后，僅在Omomyc存在的人類Hep3B細胞上觀察到活性降低(圖6D)。與單一藥物相比，Omomyc和cabozantinib聯(lián)合用藥顯著降低了細胞存活率(圖6D)。生化實驗證實了10058-F4和Omomyc對MYC轉錄功能的影響，例如SURVIVIN、MYC和CYCLIND1的下調，盡管分析的細胞系之間存在差異，并且與使用的MYC阻滯劑有關(圖6E, F)。MET水平無重大變化(圖6E,F)，這與HCC細胞在聯(lián)合使用MYC阻滯劑時對cabozantinib保持敏感性一致。我們還評估了MYC和MET單獨和聯(lián)合靶向HLE和HLF細胞的效果，這些細胞被歸類為CL3亞類。細胞活力測定證實了MYC和MET聯(lián)合靶向與單一治療相比的效力(圖7A)，生化研究證實了MYC靶向后SURVIVIN、MYC和CYCLIND1的下調(圖7B)。
為了從機制上探索單一和聯(lián)合處理之間的差異，我們在Huh7細胞中使用抗磷酸化組蛋白H3和抗切割Caspase3檢測細胞增殖和凋亡。10058-F4或cabozantinib單藥治療可輕微降低HCC細胞的增殖率，而不觸發(fā)切割Caspase3的表達(圖8A, B)。相比之下，10058-F4和cabozantinib聯(lián)合治療可誘導細胞凋亡(圖8A, B)。這些結果表明，MYC靶向使HCC細胞對cabozantinib易感，將部分細胞抑制作用(由單一治療觸發(fā))轉化為細胞毒性作用(由聯(lián)合治療實現(xiàn))。
圖6：MYC靶向賦予HCC細胞系亞群對cabozantinib治療的反應性
圖7：MYC靶向使CL3亞組的HCC細胞系對cabozantinib治療敏感
圖8：MYC和MET的聯(lián)合阻斷將輕度細胞抑制作用轉變?yōu)閺娏壹毎拘宰饔?/span>
結論：
MYC阻塞通過降低MYC靶點的表達水平使HCC細胞對cabozantinib的反應性增加，從而提供了對MET信號支持的更高程度的依賴。
參考文獻：
Sequera, C., Grattarola, M., Holczbauer, A., Dono, R., Pizzimenti, S., Barrera, G., Wangensteen, K. J., &Maina, F. (2022). MYC and MET cooperatively drive hepatocellular carcinoma with distinct molecular traits and vulnerabilities. Cell death & disease, 13(11), 994. https://doi.org/10.1038/s41419-022-05411-6.