突觸特性的確定是神經(jīng)元環(huán)路功能的基礎(chǔ)。“末端選擇”轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)終端基因電池可以指定細(xì)胞類型的特定屬性。此外,泛神經(jīng)元剪接調(diào)節(jié)因子被認(rèn)為與指導(dǎo)神經(jīng)元分化有關(guān)。然而,剪接調(diào)節(jié)因子如何指導(dǎo)特定的突觸特性的細(xì)胞邏輯仍然不清楚。本研究對小鼠海馬中替代剪接調(diào)節(jié)因子SLM2的細(xì)胞類型特異性功能進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳學(xué)分析,證明,SLM2依賴的可變剪接(AS)以跨突觸的方式專門指導(dǎo)突觸特性的規(guī)范。本文于20233年2月發(fā)表在《Cell Reports》IF: 10.0期刊上。
技術(shù)路線:
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1、SLM2的結(jié)合mRNA編碼突觸蛋白
在小鼠海馬體中,SLM2在谷氨酸能錐體細(xì)胞中表達(dá),但也在GABAergic中間神經(jīng)元亞群中表達(dá)。其中包括定向-肺泡腔隙-分子(OLM)細(xì)胞CA1,這是一類SST陽性的中間神經(jīng)元。在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi),SLM2主要集中在核亞結(jié)構(gòu)中(圖1A),讓人聯(lián)想起類核小體其由SLM2同源物SAM68組成。然而,在海馬神經(jīng)元中,只有一小部分亞核結(jié)構(gòu)顯示SLM2-SAM68共定位(圖1B)。為確定SLM2相關(guān)的RNAs,在小鼠全腦和海馬樣本上使用了增強(qiáng)型交聯(lián)和免疫沉淀(eCLIP)。77%的結(jié)合事件發(fā)生在內(nèi)含子,而只有2%映射到外顯子(圖1C)。交叉連接誘導(dǎo)截?cái)辔稽c(diǎn)(CITS)分析確定了確切的蛋白質(zhì)-RNA交叉連接位點(diǎn),這些位點(diǎn)富含UWAA元件(W=U/A;圖1D),這是SLM2在體外識別的motif。使用mCross(一種模擬RBP結(jié)合序列特異性和交聯(lián)位點(diǎn)的計(jì)算方法)進(jìn)行新的motif識別,顯示UUWAAAA 7-mer是體內(nèi)被SLM2結(jié)合的主要RNAmotif(圖1E)。使用CLIPper和IDR鑒定了復(fù)制體中的高置信度SLM2結(jié)合事件(圖1F)。對SLM2結(jié)合的mRNAs的GO分析顯示,編碼谷氨酸突觸成分的mRNAs有很強(qiáng)的富集性(圖1G)。在全腦樣本的424個高置信度的SLM2目標(biāo)mRNA中,有110個在SynGO45中被注釋為編碼突觸蛋白,其中有59個突觸前和49個突觸后成分(圖1H)。這些包括泛神經(jīng)元表達(dá)的mRNA,如Nrxn1,2,3、Nlgn1、Lrrtm4、Dlgap1,2、Tenm2和Cadm1,以及優(yōu)先在GABAergic中間神經(jīng)元表達(dá)的突觸后蛋白,如Erbb4和Gria4。在input樣本中沒有觀察到明顯的峰值,而目標(biāo)mRNA中密集的UWAAmotif簇與SLM2的結(jié)合事件緊密相連(圖1I)。這些實(shí)驗(yàn)揭示了一個編碼突觸蛋白的mRNAs陣列,它們在體內(nèi)被內(nèi)源性的SLM2結(jié)合。
圖1結(jié)合SLM2的mRNA編碼突觸蛋白
2、細(xì)胞類型特異性SLM2依賴外顯子的鑒定
RBP的作用通常依賴于表達(dá)水平。因此,定量了海馬神經(jīng)元亞群的SLM2免疫反應(yīng)性(圖2A-B)。SLM2的表達(dá)在CA3錐體細(xì)胞(Grik4-cre)中表達(dá)量最高,在CA1錐體細(xì)胞(CamK2-cre)和SST神經(jīng)元(SST-cre)中明顯表達(dá)(圖2B)。超過90%的遺傳標(biāo)記的CA1和CA3錐體細(xì)胞表達(dá)SLM2(圖S2C)。相比之下,SLM2在齒狀顆粒細(xì)胞中不表達(dá)(圖2B)。使用RiboTrap在不同細(xì)胞類型中進(jìn)行條件性消融并繪制各自細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。分別使用CamK2-cre、Grik4-cre和SST-cre品系在海馬CA1細(xì)胞,CA3錐體細(xì)胞和SST陽性GABAergic中間神經(jīng)元中選擇性消融SLM2,分別命名為Slm2△CamK2,Slm2△Grik4,Slm2△SST(圖2C和2D)。SLM2的免疫染色證實(shí)了該蛋白在Slm2△SST出生后第16-18天(P16-18)完全喪失,在Slm2△CamK2和Slm2△Grik4在出生后第42-45天(P42-45)75%-90%的cre陽性細(xì)胞中完全喪失(圖2D)。
使用RiboTrap親和分離技術(shù),對野生型和敲除型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測繪。重復(fù)樣本之間的差異很小,或者說敲除小鼠與野生型小鼠的RiboTrap樣本之間的差異很?。▓D2E),這表明SLM2的損失并不影響這些細(xì)胞類型的終端基因電池。散點(diǎn)圖進(jìn)一步證實(shí)在整體基因表達(dá)水平上只有很小的改變(圖2F)。最強(qiáng)烈改變的轉(zhuǎn)錄物是SLM2的類似物SLM1/Khdrbs2,與功能交叉抑制相一致。
圖2 海馬細(xì)胞類型中SLM2的條件消融
SLM2的缺失并沒有廣泛地改變這些細(xì)胞類型特異性的剪接特征但改變了少量的AS事件(圖3A),包括Nrxn2選擇性剪接片段4外顯子摻入(AS4)在三個細(xì)胞群中增加(圖3A-B)。相比之下,Nrxn3的相應(yīng)替代外顯子僅在CA3(Grik4)和CA1(CamK2)細(xì)胞中被去調(diào)控(圖3C)。Syntaxin結(jié)合蛋白5-like(Stxbp5l;也叫Tomosyn-2)中相互排斥的替代外顯子e23/e24的去調(diào)控是CA1和CA3而不是Slm2△SST細(xì)胞中普遍改變的另一個剪接事件(圖3A)。整合eCLIP和RiboTrap剪接分析,發(fā)現(xiàn)在去調(diào)節(jié)的替代外顯子下游500個堿基范圍內(nèi)有密集的內(nèi)含SLM2結(jié)合事件和UWAAmotif(圖3B和3C)。這表明,SLM2的結(jié)合指導(dǎo)了上游替代外顯子的跳躍。
圖3 SLM2直接調(diào)控編碼突觸蛋白的mRNA的AS
3、SLM2缺失導(dǎo)致細(xì)胞類型特異性突觸表型
考慮到SLM2對結(jié)合和調(diào)節(jié)編碼突觸蛋白的mRNA具有顯著選擇性,所以作者探討了SLM2消融的功能后果。在突觸前CA3錐體細(xì)胞中條件消融SLM2導(dǎo)致CA1神經(jīng)元中Schaffer側(cè)支刺激引起的突觸后電流顯著增加(附圖1A-C),因此,從CA3神經(jīng)元中刪除SLM2足以改變到突觸后CA1錐體細(xì)胞的突觸傳遞。從SST中間神經(jīng)元中條理性敲除SLM2(Slm2△SST)并沒有改變SST陽性中間神經(jīng)元的內(nèi)在特性(附圖1C-F),表明SLM2不是這些細(xì)胞的特異性所必需的。然而,eCLIP分析發(fā)現(xiàn)了大量的SLM2與編碼谷氨酸突觸蛋白的mRNA結(jié)合(圖1G-H),所以作者檢測了Slm2△SST細(xì)胞的谷氨酸能輸入。結(jié)果顯示SST中間神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流(mEPSC)振幅沒有變化,但觀察到mEPSC頻率顯著升高,表明Slm2△SST細(xì)胞上的谷氨酸能突觸密度增加(圖4A-E)。作者調(diào)查了對肺泡中假定的CA1軸突進(jìn)行越來越多的電刺激的AMPAR介導(dǎo)的突觸后反應(yīng),發(fā)現(xiàn)與較大的突觸數(shù)量一致的興奮明顯增加(圖4F)。此外,對同一軸突的40赫茲的刺激導(dǎo)致了短期促進(jìn)的顯著增加(圖4G)。由于該突觸的短期促進(jìn)是通過增加遞質(zhì)釋放介導(dǎo)的,這些結(jié)果表明,突觸后SST間神經(jīng)元的SLM2通過跨突觸機(jī)制控制谷氨酸傳導(dǎo)和這些細(xì)胞的突觸招募。
附圖1Slm2條件敲除細(xì)胞的電生理分析
通過光遺傳刺激SST中間神經(jīng)元和全細(xì)胞膜片鉗記錄從CA1錐體細(xì)胞來進(jìn)一步分析GABAergic SST中間神經(jīng)元的輸出突觸。發(fā)現(xiàn)Slm2△SST小鼠中光遺傳學(xué)誘發(fā)的突觸后抑制電流的大小沒有變化(圖4H)。光遺傳學(xué)誘發(fā)電流的動力學(xué)沒有改變,表明突觸后GABA A受體的組裝正常(附圖1G)。應(yīng)用10 Hz的光遺傳刺激,在野生型細(xì)胞中誘導(dǎo)OLM-CA1突觸的抑制,使用該方案,在Slm2△SST小鼠的腦片中觀察到短期抑郁有小幅但顯著的減少(附圖1H)。因此,SST中間神經(jīng)元的SLM2選擇性缺失導(dǎo)致谷氨酸能驅(qū)動增加到OLM中間神經(jīng)元,與輸出到CA1神經(jīng)元的突觸基本相似。
研究表明,光遺傳刺激誘導(dǎo)的OLM中間神經(jīng)元異常激活會損害物體識別實(shí)驗(yàn)中的物體記憶。因此,使用Slm2△SST小鼠進(jìn)行新的物體識別測試。突變型和野生型小鼠在測試場地的移動能力或與物體交互的總時(shí)間方面沒有差異(圖4I)。在測試物體識別記憶時(shí),野生型小鼠探索新物體的時(shí)間顯著增加,相比之下,Slm2△SST小鼠與新奇和熟悉的物體互動的時(shí)間相似(圖4J-K)。因此,SST中間神經(jīng)元中SLM2的選擇性缺失與小鼠短期記憶的特定缺陷有關(guān)。
圖4 SLM2通過跨突觸的方式控制突觸的可塑性和功能
總之,本研究表明AS因子SLM2結(jié)合編碼突觸蛋白的mRNA;SLM2以細(xì)胞類型特異性的方式調(diào)節(jié)剪接異構(gòu)體;SLM2缺失導(dǎo)致突觸功能的選擇性非細(xì)胞自主改變;在SST中間神經(jīng)元中缺乏SLM2的小鼠表現(xiàn)出短期記憶缺陷。
圖形摘要
參考文獻(xiàn):
Traunmüller L, Schulz J, Ortiz R, Feng H, Furlanis E, Gomez AM, Schreiner D, Bischofberger J, Zhang C, Scheiffele P. A cell-type-specific alternative splicing regulator shapes synapse properties in a trans-synaptic manner. Cell Rep. 2023 Feb 28;42(3):112173. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112173. Epub ahead of print. PMID: 36862556.