METTL3通過(guò)誘導(dǎo)線粒體自噬促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的化學(xué)耐藥性

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-05-18
既往研究表明,自噬參與了SCLC對(duì)化療的耐藥,且自噬在化療耐藥的SCLC細(xì)胞株中顯著增強(qiáng)。然而,關(guān)于線粒體自噬是否與SCLC耐藥特異性相關(guān)......



肺癌在全球所有癌癥類(lèi)型中發(fā)病率和死亡率最高,其5年總生存率較差。肺癌根據(jù)其病理特征可分為小細(xì)胞肺癌(small cell Lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌兩種亞型。SCLC因其侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、易發(fā)生耐藥而導(dǎo)致眾多患者死亡。最初,大多數(shù)SCLC患者對(duì)含鉑一線化療有應(yīng)答。然而,患者的反應(yīng)往往不持久,容易產(chǎn)生化療耐藥,導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。線粒體自噬是一種選擇性自噬,參與線粒體去極化、缺氧、發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程。因此,探索SCLC的耐藥機(jī)制對(duì)于尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。既往研究表明,自噬參與了SCLC對(duì)化療的耐藥,且自噬在化療耐藥的SCLC細(xì)胞株中顯著增強(qiáng)。然而,關(guān)于線粒體自噬是否與SCLC耐藥特異性相關(guān)的報(bào)道較少。該研究發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》,IF: 12.658。


技術(shù)路線:



主要研究結(jié)果:

1. METTL3SCLC耐藥細(xì)胞株中高表達(dá),且與患者不良預(yù)后相關(guān)

許多研究表明,m6A修飾在胃癌、肝癌等多種實(shí)體腫瘤的化療或靶向耐藥中發(fā)揮作用。為了確定m6A是否參與SCLC化療耐藥,作者對(duì)敏感和耐藥的SCLC細(xì)胞株(H69H69AR)進(jìn)行了高通量全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并分析了m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異。作者觀察到,在化療敏感和化療耐藥細(xì)胞系之間,與m6A修飾相關(guān)的7個(gè)基因的表達(dá)有顯著差異(圖1A)。采用單因素Cox回歸分析這7個(gè)基因在兩組SCLC患者中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步分析m6A相關(guān)基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。隊(duì)列1來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEOGSE60052),包括79SCLC患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù),隊(duì)列2包括58例在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院接受治療的SCLC患者。在總生存(OS)的單因素Cox回歸分析中,在兩個(gè)隊(duì)列中只有METTL3SCLC生存和預(yù)后相關(guān)(圖1B-C)。隊(duì)列1和隊(duì)列2的生存曲線均顯示,METTL3高表達(dá)與較差的OS相關(guān),METTL3是不良預(yù)后的標(biāo)志(圖1D)。

為了進(jìn)一步明確METTL3是否在SCLC化療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用,作者采用qRT-PCRWestern blot分析了METTL3在兩對(duì)化療藥物敏感和耐藥細(xì)胞株。METTL3在耐藥細(xì)胞株H69ARH446DDP中的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其對(duì)化療敏感的細(xì)胞株(圖1E-F)。免疫熒光也顯示METTL3在耐藥SCLC細(xì)胞株中高表達(dá),主要定位于細(xì)胞核,少部分位于細(xì)胞質(zhì)(圖11G)。


1METTL3SCLC中的表達(dá)及其臨床意義


2. METTL3過(guò)表達(dá)促進(jìn)SCLC化療耐藥

為了進(jìn)一步評(píng)估METTL3是否參與SCLC化療耐藥,作者使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建了穩(wěn)定敲低METTL3H69ARH446DDP細(xì)胞株。在化療后24小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)和細(xì)胞凋亡,在耐藥細(xì)胞株中敲低METTL3顯著降低了化療藥物CDDPVP16IC50(圖2A-B)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示,METTL3敲低組的凋亡細(xì)胞比例高于對(duì)照組,且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C-D)。Western blot結(jié)果顯示,敲低METTL3后,表明細(xì)胞凋亡強(qiáng)度的凋亡蛋白cleaved PARPBAX的表達(dá)水平顯著升高,而抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)水平顯著降低(圖2E)。

為了補(bǔ)充在化療耐藥細(xì)胞系中的發(fā)現(xiàn),作者在化療敏感細(xì)胞系H69H446中過(guò)表達(dá)METTL3。與空載體對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)METTL3的細(xì)胞化療IC50值顯著增加(圖2F-G)。凋亡蛋白的Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析也表明,METTL3過(guò)表達(dá)顯著降低了凋亡細(xì)胞的比例(圖2H-J)。

為了闡明METTL3誘導(dǎo)SCLC化療耐藥是否依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶功能,作者構(gòu)建了METTL3野生型和突變型重組質(zhì)粒(圖2K)。在SCLC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3顯著增加了化療藥物的IC50,而敲除METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域阻斷了METTL3誘導(dǎo)的化療耐藥(圖2L)。這些數(shù)據(jù)表明,METTL3通過(guò)其甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域調(diào)控SCLC的化療耐藥過(guò)程。


2METTL3在體外誘導(dǎo)SCLC化療耐藥


3. METTL3在體內(nèi)促進(jìn)SCLC化療耐藥

由于鉑類(lèi)-依托泊苷聯(lián)合方案仍然是SCLC的一線治療選擇,因此作者同時(shí)使用CDDPVP16在體內(nèi)研究METTL3是否參與SCLC的化療耐藥。裸鼠皮下注射敲低METTL3H69AR細(xì)胞或過(guò)表達(dá)METTL3H69細(xì)胞,并給予PBS或化療藥物(CDDP 3 mg/kgVP-16 2 mg/kg)處理。METTL3敲低顯著抑制移植腫瘤的生長(zhǎng)(圖3A),并顯著降低化療后移植腫瘤的體積(圖3B-C)。通過(guò)IHC評(píng)估腫瘤異種移植中的METTL3表達(dá)(圖3D)。相比之下,過(guò)表達(dá)METTL3H69腫瘤的生長(zhǎng)速度和體積顯著高于對(duì)照H69腫瘤(圖3E-G)。METTL3在異種移植瘤中的表達(dá)也通過(guò)IHC進(jìn)行評(píng)估(圖3H)。METTL3在體內(nèi)可促進(jìn)SCLC化療耐藥,METTL3有望成為逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的有效治療靶點(diǎn)。


3METTL3在體內(nèi)對(duì)SCLC化療耐藥性的影響


4. METTL3促進(jìn)DCP2m6A甲基化,調(diào)控DCP2的表達(dá)

為了進(jìn)一步闡明METTL3的靶基因以及METTL3促進(jìn)SCLC化療耐藥的機(jī)制,作者對(duì)METTL3敲低和對(duì)照H69AR細(xì)胞進(jìn)行了MeRIP-seq,敲低和對(duì)照細(xì)胞的m6A位點(diǎn)均高度富集了GGAC基序(圖4A)。由于METTL3是一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,作者聚焦于敲低METTL3m6A甲基化水平顯著降低的基因,并通過(guò)倍數(shù)差異選擇前20個(gè)基因。同時(shí),對(duì)敲低或過(guò)表達(dá)METTL3H446DDP和親本H446細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq檢測(cè)。然后,將MeRIP-seq基因集與RNA-seq基因經(jīng)差異分析后取P0.01的交集,發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因在三個(gè)隊(duì)列之間存在顯著差異(圖4B)。為了確定METTL3的下游靶基因,作者對(duì)三個(gè)不同的交集基因進(jìn)行了熒光qPCR,發(fā)現(xiàn)DCP2SCLCMETTL3的靶基因(圖4C-D)。來(lái)自MeRIP-seqIGV圖也顯示,METTL3敲低后,DCP2編碼區(qū)(CDS)的m6A甲基化水平顯著降低(圖4E)。MeRIP-qPCR驗(yàn)證了上述結(jié)果。在H69ARH446DDP細(xì)胞中,METTL3敲低導(dǎo)致DCP2 m6A甲基化水平顯著降低,在H69H446細(xì)胞中,METTL3過(guò)表達(dá)顯著增加DCP2 m6A甲基化水平(圖4F-G)。METTL3敲低導(dǎo)致DCP2蛋白水平顯著升高,而METTL3過(guò)表達(dá)顯著降低DCP2蛋白水平(圖4H-I)??傊?,這些發(fā)現(xiàn)表明DCP2METTL3的靶基因,并且METTL3通過(guò)誘導(dǎo)DCP2m6A甲基化來(lái)下調(diào)DCP2的表達(dá)。


4DCP2METTL3的下游靶點(diǎn)


5. DCP2通過(guò)調(diào)控線粒體自噬影響SCLC化療耐藥

為了確定METTL3對(duì)DCP2水平的調(diào)節(jié)是否有助于SCLC的化療耐藥性,作者分別在化療耐藥和化療敏感細(xì)胞系中構(gòu)建了DCP2過(guò)表達(dá)和DCP2敲低細(xì)胞。治療24 h后測(cè)定化療藥物CDDPVP16IC50。在敏感細(xì)胞中敲低DCP2顯著增加了化療藥物的IC50值(圖5A),而在耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DCP2顯著降低了化療藥物的IC50值(圖5B)。進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明,敲低METTL3后,細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加,IC50值降低。然而,當(dāng)同時(shí)敲低METTL3DCP2時(shí),由METTL3引起的化療耐藥性被恢復(fù)(圖5C-D)。

為了進(jìn)一步探索METTL3介導(dǎo)化療耐藥的可能下游機(jī)制,作者對(duì)MeRIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO通路富集分析。GO分析顯示自噬相關(guān)通路高度富集,在12條差異顯著的自噬相關(guān)通路中,有5條通路屬于“線粒體自噬伴選擇性自噬”類(lèi)別(圖5E)。為明確線粒體自噬是否參與SCLC化療耐藥,利用共聚焦顯微鏡評(píng)估SCLC化療敏感和耐藥細(xì)胞的線粒體自噬。在化療耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DCP2后,Mtphagy熒光強(qiáng)度顯著降低,并且這一發(fā)現(xiàn)在分析的兩個(gè)細(xì)胞系中一致(圖5F)。在化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2后,Mtphagy熒光強(qiáng)度顯著增加(圖5G-H)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)在耐藥細(xì)胞系中敲低METTL3時(shí),觀察到線粒體自噬減少,并且這種減少的線粒體自噬通過(guò)同時(shí)敲低METTL3DCP2而恢復(fù)(圖5I-J)。綜上所述,作者發(fā)現(xiàn)METTL3的靶基因DCP2通過(guò)影響線粒體自噬水平參與SCLC的化療耐藥過(guò)程。


5DCP2通過(guò)調(diào)控線粒體自噬預(yù)防SCLC化療耐藥


6. DCP2調(diào)控Pink1-Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬

在以往的研究中,線粒體自噬通過(guò)兩種經(jīng)典途徑發(fā)生:由膜去極化觸發(fā)的pink1-parkin介導(dǎo)的泛素依賴性途徑和受體介導(dǎo)的途徑,其核心成分包括BNIP3BNIP3L/NIXPHB2。為了探究DCP2是否通過(guò)這些已知的通路調(diào)控SCLC中的線粒體自噬,作者分析了DCP2敲低對(duì)化療敏感的細(xì)胞中線粒體自噬基因的表達(dá)變化。DCP2敲低導(dǎo)致Pink1Parkin mRNA水平升高,而BNIP3、BNIP3LPHB2mRNA水平無(wú)顯著變化(圖6A-B)。同樣,在過(guò)表達(dá)DCP2的耐藥細(xì)胞中,Pink1ParkinmRNA水平降低(圖6C)。這些結(jié)果表明,DCP2影響了Pink1ParkinmRNA穩(wěn)定性,DCP2可以誘導(dǎo)Pink1Parkin的降解。

為了進(jìn)一步研究SCLC細(xì)胞中線粒體自噬的變化,作者分析了Pink1, Parkin, LC3P62的蛋白水平。在化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2或過(guò)表達(dá)METTL3,線粒體自噬蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖6D-E)。此外,在耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DCP2或敲低METTL3,線粒體自噬蛋白水平降低(圖6F-G)。

進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)在耐藥細(xì)胞中同時(shí)敲低METTL3DCP2時(shí),敲低METTL3引起的自噬蛋白水平的變化被恢復(fù)(圖6H)。METTL3通過(guò)調(diào)控DCP2的水平,通過(guò)調(diào)控pink1-parkin介導(dǎo)的線粒體自噬參與SCLC化療耐藥。


6DCP2通過(guò)Pink1-Parkin通路調(diào)節(jié)線粒體自噬


7. DCP2調(diào)控SCLC線粒體損傷

大量研究證實(shí),化療耐藥與線粒體功能障礙有關(guān)。線粒體自噬是通過(guò)自噬對(duì)線粒體的靶向吞噬和破壞,被認(rèn)為是線粒體質(zhì)量控制的主要機(jī)制。因此,作者推測(cè)SCLC化療耐藥過(guò)程中存在線粒體損傷水平的變化。線粒體膜電位(MMP)和線粒體活性氧(mtROS)是反映線粒體活性的關(guān)鍵指標(biāo),因?yàn)樗鼈兎从沉穗娮觽鬟f和氧化磷酸化過(guò)程,而這兩個(gè)過(guò)程是生物過(guò)程和人類(lèi)癌癥發(fā)病機(jī)制中ATP產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力。作者發(fā)現(xiàn),在SCLC化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2顯著減少了線粒體ROS的產(chǎn)生,并顯著增加了MMP(圖7A-B),表明敲低DCP2可以減輕化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷。同樣,在化療耐藥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DCP2后,DCP2過(guò)表達(dá)組化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷增加(mtROS熒光強(qiáng)度增加,MMP熒光強(qiáng)度降低)(圖7C-D)。進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)在耐藥細(xì)胞中同時(shí)敲低METTL3DCP2時(shí),METTL3引起的化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷得到恢復(fù)(圖7E-F)。綜上所述,METTL3SCLC中對(duì)DCP2的調(diào)控改變了化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷水平。


7DCP2調(diào)節(jié)SCLC細(xì)胞線粒體損傷水平


8. METTL3抑制劑STM2457可在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)SCLC細(xì)胞的化療耐藥性

STM2457是一種新型、高選擇性、口服活性METTL3抑制劑,之前在一項(xiàng)急性白血病研究中已經(jīng)報(bào)告了STM2457。用不同濃度的STM2457處理正常肺上皮細(xì)胞(HBE),確定STM2457能夠在不影響正常肺上皮細(xì)胞增殖的情況下抑制SCLC細(xì)胞METTL3表達(dá)的合適濃度。分別用CDDPVP16處理細(xì)胞24 h,檢測(cè)IC50和細(xì)胞凋亡。經(jīng)STM2457處理后,CDDPVP16IC50值顯著降低(圖8A-B)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示,STM2457處理組的凋亡細(xì)胞比例高于對(duì)照組(圖8C-D)。

為觀察STM2457在體內(nèi)是否影響SCLC的耐藥性,將6.25μM STM2457處理24 hH69AR細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。與化療藥物聯(lián)用時(shí),STM2457顯著抑制了移植瘤的生長(zhǎng)速度,并顯著減小了化療后移植瘤的體積(圖8E-F)。綜上所述,METTL3抑制劑STM2457可以逆轉(zhuǎn)SCLC患者的化療耐藥,具有治療SCLC患者化療耐藥的潛力。


8METTL3抑制劑STM2457在體內(nèi)外均可逆轉(zhuǎn)SCLC細(xì)胞的化療耐藥性


結(jié)論:

該研究證實(shí)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3通過(guò)促進(jìn)DCP2m6A,誘導(dǎo)Pink1-Parkin通路介導(dǎo)線粒體自噬,減輕線粒體損傷,參與SCLC化療耐藥過(guò)程。同時(shí),新型METTL3抑制劑STM2457也被證明具有調(diào)節(jié)SCLC化療耐藥的作用。因此,METTL3有望成為逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的新靶點(diǎn)。


參考文獻(xiàn):

Sun Y, Shen W, Hu S, Lyu Q, Wang Q, Wei T, Zhu W, Zhang J. METTL3 promotes chemoresistance in small cell lung cancer by inducing mitophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 17;42(1):65.