脂肪來(lái)源干細(xì)胞外泌體中的miR-125b-5p緩解膿毒癥肺損傷中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡

實(shí)驗(yàn)方法：外泌體分離，PMEVCs分離，transwell，劃痕試驗(yàn)，管形成試驗(yàn)，ROS和抗氧化活性的檢測(cè)，small RNA測(cè)序，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，WB，ELISA，肺損傷測(cè)量，HE，免疫熒光，流式。

膿毒癥是一種發(fā)病率和死亡率高的致命疾病，急性肺損傷是其最早和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。過(guò)度炎癥引起的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）損傷在膿毒癥急性肺損傷中起重要作用。本研究旨在探討脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）外泌體對(duì)過(guò)度炎癥性PMVECs損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。我們成功分離出ADSCs外泌體，并證實(shí)了其特征。ADSCs外泌體減少了PMVECs中過(guò)度炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累和細(xì)胞損傷。此外，ADSCs外泌體抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡，上調(diào)GPX4在PMVECs中的表達(dá)。進(jìn)一步的GPX4抑制實(shí)驗(yàn)表明，ADSCs外泌體通過(guò)上調(diào)GPX4來(lái)緩解炎癥反應(yīng)引起的鐵死亡。同時(shí)，ADSCs外泌體可增加Nrf2的表達(dá)和核易位，降低Keap1的表達(dá)。miRNA分析和進(jìn)一步的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ADSCs外泌體特異性遞送miR-125b-5p可抑制Keap1，緩解鐵死亡。在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，ADSCs外泌體可減輕肺組織損傷，降低死亡率。此外，ADSCs外泌體可減輕肺組織氧化應(yīng)激損傷和鐵死亡，顯著提高Nrf2和GPX4的表達(dá)。綜上所述，我們揭示了一種新的潛在治療機(jī)制，即ADSCs外泌體中的miR-125b-5p可以通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4表達(dá)，緩解膿毒癥急性肺損傷中炎癥誘導(dǎo)的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）ADSCs和外泌體的特征

從脂肪組織分離的原代ADSCs倒置顯微鏡下呈紡錘形(圖1A)。如圖1B所示，特異性間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD73和CD90在原代ADSCs中呈陽(yáng)性表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了ADSCs的特征。然后提取外泌體，用TEM、western blot和NTA進(jìn)行鑒定。透射電鏡下分離得到的囊泡呈杯狀典型外泌體形態(tài)，具有雙層膜結(jié)構(gòu)(圖1C)。Western blot結(jié)果顯示，外泌體分子標(biāo)志物CD63、CD9和TSG101在分離顆粒中高表達(dá)(圖1D)。NTA結(jié)果顯示，顆粒直徑為50 ~ 150 nm，平均為117.5 nm(圖1E)。CD31免疫熒光結(jié)果顯示，從肺毛細(xì)血管分離的細(xì)胞被CD31陽(yáng)性染色，說(shuō)明我們成功分離了PMVECs(圖1F)。如圖1G所示，PKH26標(biāo)記的外泌體可被PMVECs吸收。這些結(jié)果都表明我們成功分離了ADSCs外泌體和PMVECs。

圖1

2）ADSCs外泌體改善了炎癥反應(yīng)引起的PMVECs損傷

從新生小鼠肺組織中成功分離出原發(fā)性PMVECs。將LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)加入PMVECs細(xì)胞誘導(dǎo)損傷。同時(shí)，在PMVECs中加入ADSCs外泌體以保護(hù)其免受巨噬細(xì)胞CM誘導(dǎo)的損傷(圖2A)。CCK8結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM處理PMVECs的細(xì)胞活力減弱(圖2B)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM處理PMVECs的細(xì)胞凋亡率顯著高于未處理的PMVECs(圖2C)。然而，當(dāng)用ADSCs外泌體處理PMVECs時(shí)，PMVECs的活力恢復(fù)(圖2B)，凋亡率減少（圖2D）。Caspase3免疫熒光結(jié)果也驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞CM對(duì)PMVECs凋亡的上調(diào)作用和ADSCs的下調(diào)作用。如圖2D所示，用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM處理PMVECs時(shí)，Ki67的熒光強(qiáng)度降低，而使用ADSCs外泌體時(shí)，Ki67的熒光強(qiáng)度升高。在成管實(shí)驗(yàn)中，巨噬細(xì)胞CM組的成管數(shù)量低于對(duì)照組和ADSCs外泌體組(圖2D)。transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)均顯示，巨噬細(xì)胞CM削弱了PMVECs的遷移能力，而ADSCs外泌體可以恢復(fù)PMVECs的遷移能力（圖2E，2F）。因此，上述結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM損傷了PMVECs的活力、增殖和遷移，而ADSCs改善了巨噬細(xì)胞CM誘導(dǎo)的損傷，減少了細(xì)胞凋亡。

圖2

3）ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累

為了揭示ADSCs外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞CM刺激的PMVECs的保護(hù)作用，我們檢測(cè)了不同處理PMVECs的ROS積累、DNA損傷和抗氧化活性。流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光結(jié)果顯示，當(dāng)PMVECs暴露于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM時(shí)，ROS的積累顯著增加，而ADSCs外泌體則減緩了ROS的積累(圖3A和3B)。8-OHdG作為DNA損傷的指標(biāo)，免疫熒光結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM可增加PMVECs中8-OHdG的表達(dá)，而ADSCs外泌體抵消了巨噬細(xì)胞CM的上調(diào)作用。在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM作用下，PMVECs中SOD含量和CAT活性降低(圖3D)。如圖3D所示，ADSCs外泌體可增加PMVECs中SOD含量和CAT活性。線粒體膜電位(MMP)是線粒體功能狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是細(xì)胞凋亡的指標(biāo)之一，可以通過(guò)膜電位敏感染料JC-1進(jìn)行檢測(cè)。如圖3E所示，在對(duì)照組和ADSCs外泌體組中，大部分線粒體呈紅色熒光，而LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM中熒光以綠色為主。即對(duì)照組和ADSCs外泌體組MMP均高于CM組?？傊?，暴露于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM導(dǎo)致PMVECs中ROS積累和氧化損傷，但ADSCs外泌體減少了PMVECs中炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的ROS積累和損傷。

圖3

4）ADSCs外泌體減少PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡

為驗(yàn)證ADSCs外泌體對(duì)PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)損傷的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)鐵死亡相關(guān)指標(biāo)。通過(guò)4-羥基壬烯醛(4HNE)修飾和丙二醛(MDA)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。如圖4A和4B所示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM顯著增加了PMVECs的脂質(zhì)過(guò)氧化表達(dá)，而ADSCs外泌體則降低了其表達(dá)。此外，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CM下調(diào)了GSH和FRAP的表達(dá)，增加了MDA的表達(dá)。但ADSCs外泌體可緩解CM誘導(dǎo)的GSH、FRAP下調(diào)和MDA升高(圖4C)。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM增強(qiáng)了4HNE的熒光強(qiáng)度，削弱了GPX4的熒光強(qiáng)度(圖4D)。ADSCs外泌體可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM引發(fā)的變化(圖4D)。western blot結(jié)果證實(shí)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM和ADSCs外泌體對(duì)4HNE和GPX4表達(dá)具有相同的調(diào)節(jié)作用(圖4E)。western blot結(jié)果顯示，CM處理的PMVECs 中HO-1和Nrf2表達(dá)略有升高，而ADCSs外泌體組HO-1和Nrf2表達(dá)顯著升高(圖4E)。綜上所述，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM可增加PMVECs 中ROS積累和鐵死亡水平，而ADSCs外泌體可使其恢復(fù)。

圖4

5）ADSCs外泌體通過(guò)上調(diào)GPX4緩解PMVECs炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡

上述結(jié)果表明，ADSCs外泌體可以抑制鐵死亡，并增加GPX4。通過(guò)GPX4抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ADSCs外泌體是否通過(guò)調(diào)節(jié)GPX4對(duì)PMVECs的鐵死亡有抑制作用。如圖5A所示，當(dāng)RSL3抑制GPX4的表達(dá)時(shí)，即使用ADSCs外泌體處理PMVECs，細(xì)胞活力和FRAP含量也會(huì)急劇下降。相反，當(dāng)RSL3抑制GPX4的表達(dá)時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化水平及其產(chǎn)物顯著升高。western blot結(jié)果顯示，RSL3處理PMVECs后，4HNE和HO-1表達(dá)顯著增加，GPX4表達(dá)明顯抑制。當(dāng)GPX4表達(dá)被RSL3抑制時(shí)，ADSCs外泌體對(duì)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡的保護(hù)作用被取消(圖5B)。也就是說(shuō)，ADSCs外泌體通過(guò)上調(diào)GPX4在PMVECs中緩解炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖5

6）ADSCs外泌體調(diào)節(jié)PMVECs中Nrf2通路的表達(dá)

Nrf2和Keap1信號(hào)通路是通過(guò)調(diào)控下游基因HO-1、GXP4、NQO1等降低氧化應(yīng)激的最關(guān)鍵、最經(jīng)典的細(xì)胞防御和生存通路之一。因此，我們檢測(cè)了Nrf2通路中重要成分的表達(dá)。如圖4E所示，western blot結(jié)果顯示，暴露于LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM時(shí)Nrf2表達(dá)略有升高，而ADSCs外泌體處理時(shí)Nrf2表達(dá)顯著升高。此外，ADSCs外泌體可以增加下游抗氧化基因HO-1和GXP4的表達(dá)(圖4E)。western blot和PCR結(jié)果也顯示ADSCs外泌體可上調(diào)Nrf2的表達(dá)，下調(diào)Nrf2的負(fù)調(diào)控因子Keap1的表達(dá)(圖6A和6B)。western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的Nrf2蛋白，結(jié)果顯示ADSCs外泌體可輕微增加細(xì)胞質(zhì)Nrf2的表達(dá)，而顯著增加細(xì)胞核Nrf2的表達(dá)(圖6C)。綜上所述，ADSCs外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4軸緩解LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CM誘導(dǎo)的ROS積累、氧化損傷和鐵死亡。

圖6

7）ADSCs外泌體通過(guò)miR-125b-5p的傳遞調(diào)控PMVECs中的Nrf2通路

為了繪制ADSCs外泌體的miRNA表達(dá)譜，進(jìn)行了微陣列分析。如圖7A所示，多達(dá)63個(gè)miRNAs在ADSCs外泌體中被檢測(cè)到。最豐富的前15個(gè)miRNAs為miR-24-3p、miR-23a-3p、miR-12136、miR-19b- 3p、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7i-5p、miR-126-5p、miR-145-5p、miR-214- 3p、miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-3662和miR-423-5p。為了預(yù)測(cè)檢測(cè)到的miRNA的潛在靶基因，我們探索了miRDB、miRtarbase、starBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)一步研究了預(yù)測(cè)靶基因。值得注意的是，Keap1是miR-125b-5p的預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)。然后，qRT-PCR結(jié)果證實(shí)miR-125b-5p在ADSCs外泌體中表達(dá)(圖7B)，并且在ADSCs外泌體處理PMVECs后，miR-125b-5p的表達(dá)大幅增加(圖7C)。隨后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證miR-125b-5p對(duì)Keap1的調(diào)控作用。如圖7D所示，miR-125b-5p的過(guò)表達(dá)降低了Keap1-3'UTR-wt報(bào)告基因的活性。即Keap1是miR-125b-5p的調(diào)控靶點(diǎn)，miR-125b-5p可以與Keap1基因的3'UTR結(jié)合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-125b-5p對(duì)Keap1的調(diào)控作用，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了miR-125b-5p的模擬物和抑制劑，并將其轉(zhuǎn)染到PMVECs中。如圖7E所示，mimic顯著促進(jìn)miR-125b-5p的表達(dá)，而inhibitor則保持不變。mimic上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)后，Keap1表達(dá)被抑制，Nrf2和GPX4表達(dá)上調(diào)。同樣，抑制劑增加了Keap1的表達(dá)，而降低了Nrf2和GPX4的表達(dá)(圖7F)。此外，我們用抑制劑轉(zhuǎn)染ADSCs外泌體，將其加入PMVECs中，并與ADSCs外泌體比較其對(duì)Keap1通路的調(diào)控作用。結(jié)果表明，當(dāng)miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制劑抑制表達(dá)時(shí)(圖7G)， Keap1的下調(diào)和Nrf2、GPX4的上調(diào)均得到緩解(圖7H)。即當(dāng)miR-125b-5p在ADSCs外泌體中被抑制表達(dá)時(shí)，ADSCs外泌體對(duì)Keap1/Nrf2/GPX4軸的調(diào)控作用被抵消。總之，ADSCs外泌體對(duì)Keap1/Nrf2/GPX4軸的調(diào)節(jié)作用取決于miR-125b-5p的傳遞。

圖7 

8）ADSCs外泌體緩解CLP誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

為了檢測(cè)ADSCs外泌體對(duì)膿毒癥急性肺損傷的保護(hù)作用，如圖8A所示，我們建立了CLP膿毒癥模型，并用ADSCs外泌體進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，CLP組小鼠24小時(shí)死亡一半，48小時(shí)死亡80%(圖8B)。當(dāng)使用ADSCs外泌體治療時(shí)，24小時(shí)死亡率下降到10%，48小時(shí)死亡率下降到60%(圖8B)。收集肺組織進(jìn)行HE染色，并通過(guò)肺損傷評(píng)分、支氣管肺泡灌洗液(BALF)和濕/干比分析進(jìn)行損傷評(píng)分。CLP組小鼠BALF中蛋白濃度及干濕比均顯著高于假手術(shù)組及ADSCs外泌體組(圖8C)。HE結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CLP組肺泡毛細(xì)血管腫脹充血，肺泡腔出血，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖D)。而ADSCs外泌體明顯改善上述損傷。此外，CLP增加了小鼠肺損傷評(píng)分，而ADSCs外泌體降低了肺損傷評(píng)分(圖8E)。因此，ADSCs外泌體緩解了CLP誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

圖8

9）ADSCs外泌體緩解CLP誘導(dǎo)的ROS并增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力
為了檢測(cè)CLP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和ADSCs外泌體對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷的影響，檢測(cè)了ROS、SOD、FRAP、MDA和GSH。如圖9A所示，結(jié)果顯示CLP處理后ROS水平明顯升高，而ADSCs外泌體可以減少ROS的積累。MDA檢測(cè)顯示，膿毒癥小鼠BALF中MDA水平遠(yuǎn)高于假手術(shù)組和ADSCs外泌體組(圖9A)。同時(shí)，CLP處理后抗氧化劑SOD、FRAP和GSH水平顯著降低，ADSCs外泌體可恢復(fù)其含量。Tunel染色顯示CLP增加小鼠肺組織凋亡，而ADSCs外泌體減輕膿毒癥大鼠肺組織凋亡(圖9B)。OHdG和CD31免疫熒光雙染色顯示CLP組CD31陽(yáng)性細(xì)胞8OHdG表達(dá)明顯升高，而ADSCs外泌體組較CLP組表達(dá)降低(圖9C)。

圖9

10）ADSCs外泌體通過(guò)上調(diào)肺組織GPX4緩解CLP誘導(dǎo)的鐵死亡

為驗(yàn)證ADSCs外泌體對(duì)CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中鐵死亡和GPX4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，采用western blot、PCR和免疫熒光染色檢測(cè)4HNE和GPX4的表達(dá)。如圖10A所示，western blot結(jié)果顯示CLP處理后肺組織中4HNE蛋白表達(dá)顯著增加，而ADSCs外泌體處理后4HNE蛋白表達(dá)顯著降低。相反，加入CLP后GPX4表達(dá)下調(diào)，加入ADSCs外泌體后GPX4表達(dá)上調(diào)。有趣的是，CLP和ADSCs外泌體均能增加HO-1的表達(dá)，而ADSCs外泌體比CLP更能增加HO-1的表達(dá)(圖10A)。4HNE、GPX4和HO-1的免疫組化染色結(jié)果也顯示CLP處理增加了肺組織中4HNE和HO-1陽(yáng)性細(xì)胞，減少了GPX4陽(yáng)性細(xì)胞(圖10B)。ADSCs外泌體減少了4HNE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，增加了GPX4和HO-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(圖10B)。PCR結(jié)果與western blot和免疫組化結(jié)果一致(圖10C)。此外，4HNE和GPX4免疫熒光染色結(jié)果也顯示CLP在肺組織中增加了4HNE表達(dá)，減少了GPX4表達(dá)，而ADSCs外泌體增加GPX4表達(dá)，降低4HNE表達(dá)(圖10D)。因此，ADSCs外泌體通過(guò)上調(diào)肺組織中的GPX4來(lái)緩解CLP誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖10 

11）ADSCs外泌體在CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中調(diào)控Keap1/Nrf2的表達(dá)

Keap1/Nrf2系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控GPX4、HO-1等一系列抗氧化基因，是氧化應(yīng)激系統(tǒng)的關(guān)鍵元件。如圖11A所示，在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織中Nrf2蛋白表達(dá)略有升高，在ADSCs外泌體處理的小鼠中Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高。然而，Keap1在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥肺組織中表達(dá)略有降低，在ADSCs外泌體處理的小鼠中表達(dá)顯著降低(圖11A)。PCR結(jié)果也顯示ADSCs外泌體處理的膿毒癥小鼠肺組織中Nrf2 mRNA表達(dá)升高(圖11A)。Nrf2和CD31免疫熒光雙染色結(jié)果顯示Nrf2在CD31+細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度高于CD31?細(xì)胞，在ADSCs外泌體小鼠肺組織中的熒光強(qiáng)度高于CLP組(圖11B)。此外，Nrf2免疫組化染色結(jié)果也表明，該抗氧化分子在CLP小鼠肺組織中略有上調(diào)，而在ADSCs外泌體作用下則顯著上調(diào)(圖11B)，因此，ADSCs外泌體調(diào)節(jié)了CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷中Keap1/Nrf2的表達(dá)。

圖11

結(jié)論：我們揭示了一種新的潛在治療機(jī)制，即ADSCs外泌體傳遞miR-125b-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/GPX4表達(dá)，緩解膿毒癥急性肺損傷所致的PMVECs鐵死亡，從而改善膿毒癥急性肺損傷。

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