ZBP1可預(yù)防m(xù)tDNA誘導(dǎo)的衰竭心臟的心肌炎癥

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-08-23
ZBP1(Z-DNA 結(jié)合蛋白1)是一種模式識別受體,可響應(yīng)炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的mtDNA 而積極調(diào)節(jié)炎癥......



       心力衰竭(HF)的患病率和發(fā)病率正在上升,并被定義為一種全球大流行,影響全球約26萬人。盡管治療取得了重大進(jìn)展,但HF的發(fā)病率和死亡率仍然很高。因此,需要對HF的病理生理學(xué)和分子機(jī)制有新的見解來開發(fā)新的治療方法。線粒體DNA(mtDNA)誘導(dǎo)的心肌炎癥與心臟重塑密切相關(guān)。ZBP1(Z-DNA 結(jié)合蛋白1)是一種模式識別受體,可響應(yīng)炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的mtDNA 而積極調(diào)節(jié)炎癥。然而,ZBP1在心肌炎癥和心臟重塑中的作用尚不清楚。該研究發(fā)表于《Circulation Research》,IF:23.213。
技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:
1. mtDNA增加ZBP1并激活心肌細(xì)胞中的炎癥信號傳導(dǎo)
       為了評估心肌細(xì)胞中ZBP1對mtDNA的表達(dá),作者將1000ng / mL從大鼠肝臟中提取的mtDNA施用到心肌細(xì)胞中,通過檢測mtDNA的一部分Cox1而不是核DNA的一部分At3來驗(yàn)證其純度(圖1A)。從mtDNA給藥24小時(shí)后,作者發(fā)現(xiàn)ZBP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平增加(圖1B和1C)隨著IL-1β和IL-6 mRNA水平的增加(圖1D)。
       此外,作者研究了ZBP1和其他與炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)的mtDNA劑量依賴性反應(yīng),包括微管相關(guān)蛋白1A / 1B- LC3(輕鏈3),RIPK3,磷酸化的NF-κB p65亞基(Ser536)和NLRP3。雖然低劑量的mtDNA(100 ng/mL)增加了LC3-II,但沒有增加ZBP1,但高劑量的mtDNA(1000 ng/mL)增加了LC3-II和ZBP1(圖1E和1F)。重要的是,只有高劑量的mtDNA才能增加RIPK3,磷酸化的NF-κB,NLRP3和磷酸化TBK1的蛋白質(zhì)水平,它們是炎癥的主要介質(zhì)(圖1F)。此外,高劑量的mtDNA增加了IL-1β和IL-6的mRNA水平,而低劑量則沒有(圖1G)。這些數(shù)據(jù)表明,雖然低劑量的mtDNA通過自噬激活和處理,如LC3-II的增加所證明的那樣,高劑量的mtDNA不僅誘導(dǎo)自噬,而且還增加ZBP1和其他炎癥相關(guān)蛋白,導(dǎo)致心肌炎癥。


圖1 mtDNA增加ZBP1并激活心肌細(xì)胞中的炎癥信號傳導(dǎo)

2. ZBP1敲低加劇了用mtDNA處理的心肌細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的增加
       接下來,作者研究了ZBP1在心肌細(xì)胞中響應(yīng)1000 ng / mL mtDNA的功能作用。小干擾RNA敲低有效抑制了ZBP1的mRNA和蛋白質(zhì)水平(圖2A和2B)。出乎意料的是,盡管ZBP-1已被報(bào)道介導(dǎo)炎癥,但ZBP1敲低加劇了mtDNA誘導(dǎo)的RIPK3,磷酸化NF-κB和NLRP3的增加(圖2B)。與這些結(jié)果一致,ZBP1敲低進(jìn)一步增加了用mtDNA處理的心肌細(xì)胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平(圖2C)。TBK1是ZBP1的另一個(gè)下游靶標(biāo)。盡管高劑量的mtDNA增加了TBK1的磷酸化(圖1F),ZBP1敲低沒有影響它(圖2D)。這些發(fā)現(xiàn)表明,ZBP1負(fù)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中的RIPK3,NF-κB和炎性細(xì)胞因子,但不是TBK1。


圖2 ZBP1敲低會加劇用mtDNA處理的心肌細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的增加

3. 在mtDNA處理的心肌細(xì)胞中,敲低RIPK3可通過敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3軸的增加
       為了研究ZBP1和RIPK3之間的關(guān)系,并闡明RIPK3是否可以介導(dǎo)炎癥作為ZBP1的下游靶標(biāo),作者進(jìn)行了ZBP1和RIPK3的雙重敲低實(shí)驗(yàn)。雙敲低有效降低了這些蛋白質(zhì)(圖3A)。重要的是,RIPK3敲低減弱了mtDNA處理的心肌細(xì)胞中ZBP3敲低磷酸化NF-κB和NLRP1增加的惡化(圖3A)。RIPK3敲低也降低了IL-1β和IL-6的mRNA水平(圖3B)。這些發(fā)現(xiàn)表明RIPK3正調(diào)控NF-κB和NLRP3,ZBP1通過抑制RIPK3發(fā)揮抗炎作用。相反,mtDNA和ZBP1敲低都不影響細(xì)胞存活(圖3C),表明ZBP1-RIPK3軸不能直接調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞死亡。


圖3在mtDNA處理的心肌細(xì)胞中,敲低RIPK3可通過敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3軸的增加

4. 在mtDNA處理的心肌細(xì)胞中,敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3軸的增加
       接下來,作者研究了NF-κB是否可以介導(dǎo)炎癥作為ZBP1的下游靶標(biāo)。作者發(fā)現(xiàn)NF-κB敲低減輕了mtDNA處理的心肌細(xì)胞中ZBP3敲低NLRP3增加的惡化,但不能減輕RIPK1的惡化(圖4A)。重要的是,這些變化伴隨著IL-1β和IL-6的mRNA水平的降低(圖4B)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明ZBP1通過抑制NF-κB途徑發(fā)揮抗炎作用。


圖4 在mtDNA處理的心肌細(xì)胞中,敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3軸的增加

5. ZBP1負(fù)調(diào)節(jié)CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)
       眾所周知,ZBP1可以感知線粒體和核DNA。為了鑒定刺激心肌細(xì)胞中ZBP1的DNA類型,作者使用了模擬mtDNA的CpG-寡脫氧核苷酸和模擬核DNA的對照寡脫氧核苷酸。作者發(fā)現(xiàn)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CpG-寡脫氧核苷酸與mcherry標(biāo)記的ZBP1共定位(圖5A)。5CpG-寡脫氧核苷酸增加ZBP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平(圖5B和5C)和ZBP1敲低進(jìn)一步增加了用CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細(xì)胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平(圖5D)。這些發(fā)現(xiàn)表明,ZBP1可以感知心肌細(xì)胞中的線粒體和核DNA,并負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥以響應(yīng)它們。


圖5 ZBP1和CpG-ODN的相互作用參與ZBP1在CpG-ODN處理的心肌細(xì)胞中的抗炎作用

6. TLR9 敲低通過抑制 RIPK3、NF-κB 和 NLRP3 來改善 mtDNA 或 CpG-寡脫氧核苷酸處理的心肌細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)
      接下來,作者試圖研究mtDNA處理的心肌細(xì)胞中TLR9,ZBP1和RIPK3之間的關(guān)系。CpG-寡脫氧核苷酸,也稱為TLR9刺激劑,被發(fā)現(xiàn)增加心肌細(xì)胞中的RIPK3表達(dá)(圖5E),表明RIPK3是TLR9的下游。作者證實(shí)TLR9敲低有效地降低了其mRNA水平(圖5F)。此外,作者發(fā)現(xiàn)TLR9敲低增強(qiáng)了mtDNA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ZBP1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的增加(圖5G和5H)和加劇的CpG-寡脫氧核苷酸誘導(dǎo)的ZBP1增加(圖5I)。這些數(shù)據(jù)表明ZBP1阻礙了mtDNA和TLR9之間的相互作用,從而預(yù)防了下游炎癥信號傳導(dǎo)。

7. 心肌梗死后衰竭心臟的ZBP1和胞質(zhì)mtDNA增加
      為了評估ZBP1在衰竭心臟中的作用,作者在小鼠中進(jìn)行了MI的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。作者在MI模型中驗(yàn)證了梗死。作者發(fā)現(xiàn),心肌梗死術(shù)后1天,心肌梗死后心臟非梗死區(qū)域的ZBP3蛋白水平升高(圖6A)。接下來,作者分析了MI模型中胞質(zhì)部分的DNA水平。作者對GAPDH、線粒體標(biāo)志物COX4和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3進(jìn)行了免疫印跡驗(yàn)證了胞質(zhì)組分的純度(圖6B)。Dloop是mtDNA的一種成分,在細(xì)胞溶質(zhì)部分中在對照心臟中大量檢測到,并在MI后心臟中增加(圖6B)。相反,核DNA的組成部分Tert和B2m在對照和心肌梗死后心臟中均略有檢測到(圖6B)??傮w而言,這些數(shù)據(jù)表明ZBP1與衰竭心臟中胞質(zhì)mtDNA的增加有關(guān)。


圖6 ZBP1敲除通過 RIPK3-NF-κB-NLRP3途徑增強(qiáng)衰竭心臟的心肌炎癥

8. ZBP1 敲除加劇心功能不全和心肌梗死后重塑
       ZBP1基因敲除小鼠在心肌梗死后左心室(LV)舒張和收縮壓直徑增加,左心室射血分?jǐn)?shù)降低,心臟衰竭部分縮短(圖7A)。ZBP1敲除也加劇了全心重和左心室體重的增加(圖7B)。在病理分析中,ZBP1敲除增強(qiáng)了衰竭心臟的膠原蛋白體積,這是心臟纖維化的指標(biāo),但不是橫截面積,心肌細(xì)胞肥大的指數(shù)(圖7C)。這些數(shù)據(jù)表明,ZBP1 敲除會加劇心肌梗死后的心功能不全和重塑。


圖7 ZBP1敲除會加劇心肌梗死后的心功能障礙和重塑

結(jié)論:
       ZBP1作為RIPK3-NF-κB通路的心肌炎癥內(nèi)源性抑制因子,在心臟重塑中起保護(hù)作用。旨在通過ZBP1干擾心肌炎癥的治療策略可能有助于預(yù)防心臟重塑和衰竭。
示意圖:
       ZBP1在心肌炎癥和重塑中的作用示意圖


實(shí)驗(yàn)方法:
細(xì)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng),免疫印跡,細(xì)胞活力檢測,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn):
Enzan N, Matsushima S, Ikeda S, Okabe K, Ishikita A, Yamamoto T, et al. ZBP1 Protects Against mtDNA-Induced Myocardial Inflammation in Failing Hearts. Circ Res. 2023 Apr 28;132(9):1110-1126.